Mus og rotter implanteres kirurgisk med fjerntemperaturtranspondere og tilvænnes derefter til testmiljøet og proceduren. Ændringer i muskeltemperatur måles som reaktion på farmakologiske eller kontekstuelle stimuli i hjemmeburet eller under foreskrevet fysisk aktivitet (dvs. løbebånd, der går med konstant hastighed).
Skeletmuskulatur termogenese giver en potentiel vej til bedre forståelse af metabolisk homeostase og de mekanismer, der ligger til grund for energiforbrug. Overraskende få beviser er tilgængelige for at forbinde de neurale, myocellulære og molekylære mekanismer af termogenese direkte til målbare ændringer i muskeltemperaturen. Dette papir beskriver en metode, hvor temperaturtranspondere bruges til at hente direkte målinger af mus og rotte skeletmuskeltemperatur.
Fjerntranspondere implanteres kirurgisk i musklerne hos mus og rotter, og dyrene får tid til at komme sig. Mus og rotter skal derefter gentagne gange vænne sig til testmiljøet og proceduren. Ændringer i muskeltemperaturen måles som reaktion på farmakologiske eller kontekstuelle stimuli i hjemmeburet. Muskeltemperatur kan også måles under foreskrevet fysisk aktivitet (dvs. løbebåndsgang med konstant hastighed) for at indregne ændringer i aktivitet som bidragydere til ændringer i muskeltemperatur induceret af disse stimuli.
Denne metode er med succes blevet brugt til at belyse mekanismer, der ligger til grund for muskeltermogenisk kontrol på niveau med hjernen, det sympatiske nervesystem og skeletmuskulaturen. Forudsat er demonstrationer af denne succes ved hjælp af rovdyrlugt (PO; ilderlugt) som en kontekstuel stimulus og injektioner af oxytocin (Oxt) som en farmakologisk stimulus, hvor rovdyrlugt inducerer muskeltermogenese, og Oxt undertrykker muskeltemperatur. Således viser disse datasæt effektiviteten af denne metode til at detektere hurtige ændringer i muskeltemperaturen.
Inden for metabolisk forskning er undersøgelsen af skeletmuskulatur termogenese en lovende ny vej til sondering af kropsvægt homeostase. Den offentliggjorte litteratur understøtter ideen om, at de termogene reaktioner fra et af kroppens største organsystemer – skeletmuskulaturen – giver mulighed for at øge energiforbruget og andre metaboliske virkninger og derved effektivt afbalancere systemer inden for sygdomme som fedme 1,2,3. Hvis musklen kan betragtes som et termogent organ, skal undersøgelser anvende en praktisk metode til at studere termogene ændringer i dette organ. Ønsket om at forstå skeletmuskulaturens endotermiske virkning og nytten af denne metode til undersøgelse af ikke-rystende muskeltermogenese er ikke specifik for metaboliske undersøgelser. Discipliner, herunder evolution4, komparativ fysiologi5 og økofysiologi6,7, har vist en interesse i at forstå de måder, hvorpå muskeltermogenese kan bidrage til endotermi, og hvordan denne mekanisme tilpasser sig miljøet. Den fremlagte protokol indeholder de kritiske metoder, der er nødvendige for at løse disse spørgsmål.
Den leverede metode kan bruges til vurdering af både kontekstuel og farmakologisk stimulimodulation af muskeltemperatur, herunder den unikke teknik til at give rovdyrlugt (PO) for at skifte kontekst for at replikere rovdyrtrussel. Tidligere rapporter har vist PO’s evne til hurtigt at fremkalde en betydelig stigning i muskeltermogenese8. Desuden kan farmakologiske stimuli også ændre muskeltemperaturen. Dette er blevet demonstreret i forbindelse med PO-induceret muskeltermogenese, hvor farmakologisk blokade af perifere β-adrenerge receptorer ved hjælp af nadolol hæmmede PO’s evne til at inducere muskeltermogenese uden signifikant at påvirke kontraktil termogenese under løbebåndsgang8. Central administration af melanocortinreceptoragonister hos rotter er også blevet brugt til at skelne hjernemekanismer, der ændrer termogenese 9,10.
Her gives en foreløbig undersøgelse af neurohormonet oxytocins (Oxt) evne til at ændre muskeltermogenese hos mus. I lighed med rovdyrtrussel øger sociale møder med en artsfælle af samme køn kropstemperaturen, et fænomen kaldet social hypertermi11. I betragtning af Oxts relevans for social adfærd12 er det blevet spekuleret i, at Oxt er en formidler af social hypertermi hos mus. Faktisk nedsætter en oxytocinreceptorantagonist social hypertermi hos mus11, og musehvalpe, der mangler Oxt, viser underskud i adfærdsmæssige og fysiologiske aspekter af termoregulering, herunder termogenese13. I betragtning af at Harshaw et al. (2021) ikke fandt beviser, der understøtter β3 adrenerg receptorafhængig brunt fedtvæv (BAT) termogenese med social hypertermi11, er det blevet hævdet, at social hypertermi kan være drevet af Oxts induktion af muskeltermogenese.
For at måle skeletmuskeltermogenese bruger følgende protokol implantation af forprogrammerede IPTT-300-transpondere ved siden af muskelen af interesse i en mus eller rotte 8,10,14,15. Disse transpondere er glasindkapslede mikrochips, der læses ved hjælp af tilsvarende transponderlæsere. Lidt eller ingen forskning har udnyttet denne teknologi i denne egenskab, selvom undersøgelser har antydet et behov for specificiteten ved denne metode16,17. Tidligere undersøgelser har vist pålideligheden af denne metode og en række forskellige måder, hvorpå temperaturtranspondere kan anvendes i sammenligning med andre temperaturtestmetoder18 eller i forbindelse med kirurgiske metoder (f.eks. Kannulation19). Undersøgelser af denne art er imidlertid afhængige af forskellige strategiske placeringer for at måle den samlede kropstemperatur 20,21,22 eller specificeret væv såsom BAT23,24,25.
I stedet for at måle temperatur fra disse steder eller ved hjælp af øre- eller rektaltermometre26, giver metoden beskrevet her specificitet for muskelen af interesse. Evnen til at målrette et sted ved direkte at implantere transpondere ved siden af musklerne af interesse er mere effektiv til specifikt at undersøge muskeltermogenese. Det giver en ny vej ud over dem, der leveres af overfladeinfrarød termometri 27,28 eller kutane temperaturmålinger via termoelement 29. Desuden tilbyder de data, der leveres gennem denne metode, en række forskningsmuligheder, hvilket undgår behovet for stort, dyrt, højteknologisk udstyr og software såsom infrarød termografi30,31,32.
Denne metode er med succes blevet brugt til at måle temperaturen i quadriceps og gastrocnemius, enten ensidigt eller bilateralt. Denne metode har også været effektiv i forbindelse med stereotaxisk kirurgi14,15. Inden for ~ 7-10 cm fra transponderlemmen bruges bærbare transponderlæsere (DAS-8027 / DAS-7007R) til at scanne, måle og vise temperaturen. Denne afstand har været kritisk og værdifuld for tidligere undersøgelser 8,9,10, fordi den minimerer potentielle stressfaktorer og temperaturændrende variabler såsom dyrehåndtering under testprocedurerne. Ved hjælp af timere kan målinger derefter registreres og indsamles over en periode uden direkte interaktion med dyrene.
For yderligere at minimere forstyrrelser af mus under test beskriver denne metode samling og brug af stigerør lavet af PVC-rør for at give eksperimentatoren adgang til bunden af hjemmeburene under test. Ved hjælp af stigrørene sammen med den digitale læser kan temperaturmålinger af transponderlemmen foretages uden nogen dyreinteraktion, efter at stimulus er placeret. Til en minimal pris kan denne metode bruges sammen med farmakologiske og kontekstuelle stimuli, hvilket gør den ret tilgængelig for forskere. Derudover kan denne metode anvendes med et betydeligt antal forsøgspersoner (~ 16 mus eller ~ 12 rotter) ad gangen, hvilket sparer tid til at øge den samlede gennemstrømning for ethvert forskningsprojekt.
Introduceret i denne metode er en udformet mekanisme til præsentation af lugt til mus ved hjælp af rustfrit stål mesh te infuser bolde, fra nu af kaldet “te bolde”. Selvom disse tekugler er ideelle til at indeholde lugtmateriale, placeres håndklæder, der fungerede som sengetøj i buret over 2-3 uger til fritter, et naturligt rovdyr af mus og rotter, i disse undersøgelser inden for hver behandlingstekugle. Hvert håndklæde skæres i firkanter på 5 cm x 5 cm. Denne aliquoting gentages også med ellers identiske lugtfri kontrolhåndklæder. At præsentere disse lugte uden en barriere (dvs. tekugle) førte til, at mus makulerede fibrene i deres bure, hvilket øgede fysisk aktivitet. Denne adfærd var ikke så fremtrædende hos rotter. Tekugler giver et ventileret hus til håndklædet, hvilket giver fuld adgang til lugten, mens de forbliver beskyttet i hele det eksperimentelle forsøg. Disse tekugler kan desinficeres i overensstemmelse med dyrebrugsprotokoller, fremstilles og introduceres direkte efter operationen for at begynde at vænne dyrene til strukturen sammen med kontrolstimuleringen. Mus kan derefter leve med den ekstra berigelse, hvilket reducerer betydningen af den akutte stimuluspræsentation.
Tilvænning til tilstedeværelsen af tekuglen er kun et aspekt af tilvænning, der er kritisk for denne metode. Den beskrevne tilvænningsprotokol består også af gentagen eksponering for testproceduren for at normalisere testmiljøet (dvs. personale, transport og bevægelse til teststedet, eksponering for stimulus). Denne udvidede tilvænning minimerer nuancerede reaktioner fra dyrene og fokuserer målinger på de ønskede afhængige variabler (f.eks. Farmakologiske eller kontekstuelle stimuli). Ved en tidligere vurdering af denne protokol er fire forsøg identificeret som det mindste antal tilvænninger, der er nødvendige før temperaturtest i hjemmebure hos rotter8. Hvis testen er adskilt af lange perioder (mere end 2-3 uger), skal dyrene vænne sig igen. Ved gentagen tilvænning er mindst et til to forsøg tilstrækkeligt. Men hvis temperaturtest adskilles af mere langvarige anfald af tid, kan det være nødvendigt at gentage flere forsøg.
I den fortsatte indsats for at vænne mus og rotter til testproceduren bør en akklimatiseringsperiode før stimuluspræsentation indgå i hvert eksperimentelt forsøg. Denne akklimatiseringstid er afgørende for at genbalancere temperatur og aktivitet efter at være flyttet til teststedet. Gnavere har tendens til at have kraftige temperaturstigninger på grund af translokation. Akklimatisering bør bestå af mindst 1 time uden interaktion fra forsøgslederen på testdagen før tilsætning af et farmakologisk middel eller kontekstuelle stimuli. Dette er nødvendigt hver testdag.
I de skitserede temperaturtest i hjemmeburet har mus frit område af deres hjemmebur til at strejfe som reaktion på den testede stimulus. Dette kan forårsage variable skift i aktivitet, påvirke nøjagtigheden af temperaturaflæsninger og derfor analysen af de termogene virkninger af den uafhængige variabel (f.eks. Farmakologisk eller kontekstuel stimulus). I erkendelse af de potentielle temperaturændringer på grund af aktivitetsniveau er der inkluderet en protokol nedenfor, der beskriver brugen af temperatur under løbebåndsgang. Den offentliggjorte litteratur beskriver den vellykkede anvendelse af denne procedure hos rotter, og den anvendes i øjeblikket med mus 8,10,14,15. Løbebåndsgang opretholder en konstant aktivitetshastighed for testpersonen. Til denne undersøgelse bruges løbebånd strengt til at kontrollere aktivitetsniveauet og er derfor indstillet til den laveste tilgængelige hastighed på løbebåndet for at fremme gang for mus og en tilsvarende lav indstilling for rotter.
Følgende procedure er skitseret til temperaturmåling af ensidig gastrocnemius i mus og rovdyr lugt præsentation. Designet kan bruges sammen med farmakologiske midler og kan overføres til rotter og andre skeletmuskelgrupper (dvs. quadriceps) hos mus. For rotter kan transpondere placeres i gastrocnemius bilateralt og i brunt fedtvæv. På grund af størrelses- og afstandsbegrænsninger kan der kun bruges en transponder pr. Mus. Mindre ændringer (f.eks. fjernelse af kontekstuelle stimuli) kan foretages for at vurdere termogene reaktioner på farmakologiske midler.
Denne temperaturtestprotokol giver feltet en mulighed for at måle skeletmuskulatur termogenese direkte. Dette er kritisk, da forskning dykker ned i at identificere de mekanismer, der ligger til grund for muskeltermogenese33. Metoden giver to omkostningseffektive protokoller til måling af skeletmuskulatur termogenese under kontekstuelle og farmakologiske forhold. Denne protokol understreger betydningen af både tilvænning og akklimatisering inden for disse procedurer. Tilvænning bruges til gent…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af R15 DK097644 og R15 DK108668. Vi takker Dr. Chaitanya K Gavini og Dr. Megan Rich for tidligere bidrag og Dr. Stanley Dannemiller for at sikre vores overholdelse af institutionelle retningslinjer for brug af dyr. En særlig tak til Dr. Tim Bartness for at levere den grundlæggende forskning, der er nødvendig for at opbygge denne metode og dens tilknyttede undersøgelser. Figur 1A, C, D og figur 2A blev oprettet ved hjælp af Biorender.com.
1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter | BrassCraft | ||
1 mL Syringes | Fisher Scientific | BD 309659 | |
Betadine Swabs | Fisher Scientific | 19-898-945 | |
Booster Coil | BioMedic Data Systems | Transponder Accessory | |
Electric Clippers | Andis | 40 Ultraedge Clipper Blade | |
Flexible Mirror Sheets | Amazon | Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles | |
Forceps | Fisher Scientific | 89259-940 | |
Heating Pad | |||
Induction Chamber (isoflurane) | Kent Scientific | VetFlo-0730 | 3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers |
Ketoprophen | Med-Vet Intl. | RXKETO-50 | |
Magnetic Strips | Amazon | ||
Magnets | Amazon | DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs | |
Needles | Med-Vet Intl. | 26400 | |
Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g | Med-Vet Intl. | RXNPB-HC | |
Oasis Absorbable Suture | Med-Vet Intl. | MV-H821-V | |
Predator (Ferret) Odor Towels | Marshall BioResources | ||
PVC pipe | |||
Reflex Wound Clip Remover | CellPoint Scientific | ||
Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | ||
Reflex Wound Clip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | ||
Srerile Autoclip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (mouse) | |
Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser | Amazon | ||
Sterile Autoclip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (rat) | |
Sterile Saline | Med-Vet Intl. | RX0.9NACL-10 | |
Surgical Scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
Surgical Sheets | |||
Towels (Control/Habituation) | Amazon | 100% Cotton Towels, white | |
Transponders | BioMedic Data Systems | Model: IPTT-300 | |
Transponders Reader | BioMedic Data Systems | Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R | |
Versaclean | Fisher Scientific | 18-200-700 | liquid detergent |
Webcol Alcohol Preps | Covidien | 22-246-073 | |
Wedge pieces for PVC pipe |