Måling av skjelettmuskulaturtermogenese hos mus og rotter

Summary

Mus og rotter blir kirurgisk implantert med fjerntemperaturtranspondere og deretter habituert til testmiljøet og prosedyren. Endringer i muskeltemperatur måles som respons på farmakologiske eller kontekstuelle stimuli i hjemmeburet eller under foreskrevet fysisk aktivitet (dvs. tredemølle som går med konstant hastighet).

Abstract

Skjelettmuskulaturtermogenese gir en potensiell vei for bedre forståelse av metabolsk homeostase og mekanismene som ligger til grunn for energiforbruket. Overraskende lite bevis er tilgjengelig for å knytte nevrale, myocellulære og molekylære mekanismer for termogenese direkte til målbare endringer i muskeltemperatur. Denne artikkelen beskriver en metode der temperaturtranspondere brukes til å hente direkte målinger av muskeltemperaturen hos mus og rotter.

Fjerntranspondere blir kirurgisk implantert i muskelen til mus og rotter, og dyrene får tid til å komme seg. Mus og rotter må da gjentatte ganger vennes til testmiljøet og prosedyren. Endringer i muskeltemperatur måles som respons på farmakologiske eller kontekstuelle stimuli i hjemmeburet. Muskeltemperatur kan også måles under foreskrevet fysisk aktivitet (dvs. tredemølle som går med konstant hastighet) for å faktorisere endringer i aktivitet som bidragsytere til endringene i muskeltemperatur indusert av disse stimuliene.

Denne metoden har blitt brukt til å belyse mekanismer som ligger til grunn for muskeltermogen kontroll på hjernenivå, sympatisk nervesystem og skjelettmuskulatur. Forutsatt er demonstrasjoner av denne suksessen ved hjelp av rovdyr lukt (PO; ilder lukt) som en kontekstuell stimulus og injeksjoner av oksytocin (Oxt) som en farmakologisk stimulus, hvor rovdyr lukt induserer muskeltermogenese, og Oxt undertrykker muskeltemperatur. Dermed viser disse datasettene effekten av denne metoden for å oppdage raske endringer i muskeltemperaturen.

Introduction

Innen metabolsk forskning er undersøkelsen av skjelettmuskulaturtermogenese en lovende ny vei for sondering av kroppsvekthomeostase. Den publiserte litteraturen støtter ideen om at termogene responser fra et av kroppens største organsystemer – skjelettmuskulaturen – gir en mulighet for å øke energiforbruket og andre metabolske effekter, og dermed effektivt balansere systemer innen sykdommer som fedme ^1,2,3. Hvis muskelen kan betraktes som et termogent organ, må studiene bruke en praktisk metodikk for å studere termogene endringer i dette organet. Ønsket om å forstå den endotermiske effekten av skjelettmuskler og nytten av denne metoden for å studere ikke-skjelvende muskeltermogenese er ikke spesifikk for metabolske studier. Disipliner inkludert evolusjon⁴, komparativ fysiologi⁵ og økofysiologi ^6,7 har vist en egeninteresse i å forstå hvordan muskeltermogenese kan bidra til endotermi og hvordan denne mekanismen tilpasser seg miljøet. Den presenterte protokollen gir de kritiske metodene som er nødvendige for å løse disse spørsmålene.

Den angitte metoden kan brukes i vurderingen av både kontekstuell og farmakologisk stimulimodulering av muskeltemperatur, inkludert den unike teknikken for å gi rovdyrlukt (PO) for å skifte konteksten for å replikere rovdyrtrussel. Tidligere rapporter har vist POs evne til raskt å indusere en betydelig økning i muskeltermogenese⁸. Videre kan farmakologiske stimuli også endre muskeltemperaturen. Dette har blitt demonstrert i sammenheng med PO-indusert muskeltermogenese, hvor farmakologisk blokkering av perifere β-adrenerge reseptorer, ved bruk av nadolol, hemmet POs evne til å indusere muskeltermogenese uten signifikant å påvirke kontraktil termogenese under tredemøllevandring⁸. Sentral administrasjon av melanokortinreseptoragonister hos rotter har også blitt brukt til å skille hjernemekanismer som endrer termogenese ^9,10.

Gitt her er en foreløpig undersøkelse av evnen til nevrohormonet oksytocin (Oxt) til å endre muskeltermogenese hos mus. I likhet med rovdyrtrussel øker sosiale møter med en likekjønnet konspecifik kroppstemperaturen, et fenomen som kalles sosial hypertermi¹¹. Gitt relevansen av Oxt for sosial atferd¹², har det blitt spekulert i at Oxt er en formidler av sosial hypertermi hos mus. Faktisk reduserer en oksytocinreseptorantagonist sosial hypertermi hos mus¹¹, og musevalper som mangler Oxt viser underskudd i atferdsmessige og fysiologiske aspekter ved termoregulering, inkludert termogenese¹³. Gitt at Harshaw og medarbeidere (2021) ikke fant bevis som støtter β3 adrenerg reseptoravhengig brunt fettvev (BAT) termogenese med sosial hypertermi¹¹, har det blitt hevdet at sosial hypertermi kan være drevet av Oxts induksjon av muskeltermogenese.

For å måle skjelettmuskulaturtermogenese bruker følgende protokoll implantasjon av forhåndsprogrammerte IPTT-300-transpondere ved siden av muskelen av interesse i en mus eller rotte ^8,10,14,15. Disse transpondere er glassinnkapslede mikrochips som leses ved hjelp av tilsvarende transponderlesere. Lite eller ingen forskning har benyttet denne teknologien i denne kapasiteten, selv om studier har antydet et behov for spesifisiteten som tilbys av denne metoden^16,17. Tidligere undersøkelser har vist påliteligheten til denne metoden og en rekke måter som temperaturtranspondere kan brukes i sammenligning med andre temperaturtestmetoder¹⁸ eller i forbindelse med kirurgiske metoder (f.eks. Kanylering¹⁹). Imidlertid er studier av denne art avhengige av forskjellige strategiske plasseringer for å måle total kroppstemperatur 20,21,22 eller spesifisert vev som BAT^23,24,25.

I stedet for å måle temperaturen fra disse stedene eller mens du bruker øre- eller rektaltermometre²⁶, gir metoden beskrevet her spesifisitet for muskelen av interesse. Evnen til å målrette mot et sted ved direkte implantering av transpondere ved siden av musklene av interesse er mer effektiv for å undersøke muskeltermogenese spesielt. Det gir en ny vei i tillegg til de som tilbys av overflate infrarød termometri ^27,28 eller kutane temperaturmålinger via termoelement ²⁹. Videre tilbyr dataene som leveres gjennom denne metoden en rekke forskningsveier, og unngår behovet for stort, dyrt, høyteknologisk utstyr og programvare som infrarød termografi^30,31,32.

Denne metoden har blitt brukt til å måle temperaturen i quadriceps og gastrocnemius, enten ensidig eller bilateralt. Denne metoden har også vært effektiv i forbindelse med stereotaksisk kirurgi^14,15. Innenfor ~7-10 cm fra transponderlemmen brukes bærbare transponderlesere (DAS-8027/DAS-7007R) til å skanne, måle og vise temperaturen. Denne avstanden har vært kritisk og verdifull for tidligere undersøkelser ^8,9,10 fordi den minimerer potensielle stressorer og temperaturreduserende variabler som dyrehåndtering under testprosedyrene. Ved hjelp av tidtakere kan målinger deretter registreres og samles inn over en periode uten direkte interaksjon med dyrene.

For ytterligere å minimere forstyrrelsen av mus under testing, beskriver denne metoden montering og bruk av stigerør laget av PVC-rør for å gi eksperimentøren tilgang til bunnen av hjemmeburene under testing. Ved hjelp av stigerørene i tandem med den digitale leseren, kan temperaturmålinger av transponderlemmen gjøres uten dyreinteraksjon etter at stimulansen er plassert. Til en minimal kostnad kan denne metoden brukes sammen med farmakologiske og kontekstuelle stimuli, noe som gjør den ganske tilgjengelig for forskere. I tillegg kan denne metoden brukes med et betydelig antall (~ 16 mus eller ~ 12 rotter) om gangen, noe som sparer tid for å øke den totale gjennomstrømningen for ethvert forskningsprosjekt.

Introdusert i denne metoden er en utformet mekanisme for å presentere lukt til mus ved hjelp av rustfritt stål mesh te infuser baller, fra nå av referert til som “te baller”. Selv om disse teballene er ideelle for å inneholde luktmateriale, er håndklær som fungerte som sengetøy i buret over 2-3 uker for ildere, et naturlig rovdyr av mus og rotter, plassert i hver behandling teball. Hvert håndkle er kuttet i 5 cm x 5 cm firkanter. Denne aliquotingen gjentas også med ellers identiske luktfrie kontrollhåndklær. Å presentere disse luktene uten en barriere (dvs. teball) førte til at mus makulerte fibrene i burene sine, og økte fysisk aktivitet. Denne oppførselen var ikke så fremtredende hos rotter. Teballer gir et ventilert foringsrør til håndkleet, noe som gir full tilgang til lukten mens de forblir beskyttet for hele den eksperimentelle forsøket. Disse teballene kan desinfiseres i samsvar med dyrebruksprotokoller, tilberedes og introduseres direkte etter operasjonen for å begynne å tilvenne dyrene til strukturen sammen med kontrollstimuleringen. Mus kan da leve med den ekstra anrikningen, og redusere salience av den akutte stimuluspresentasjonen.

Tilvenning til tilstedeværelsen av teballen er bare ett aspekt av habituation som er kritisk for denne metoden. Den beskrevne tilvenningsprotokollen består også av gjentatt eksponering for testprosedyren for å normalisere testmiljøet (dvs. personell, transport og bevegelse til teststedet, eksponering for stimulans). Denne utvidede tilvenningen minimerer nyanserte responser fra dyrene og fokuserer målinger på de ønskede avhengige variablene (f.eks. Farmakologiske eller kontekstuelle stimuli). Tidligere vurdering av denne protokollen har identifisert fire forsøk som minimum antall habituations nødvendig før temperaturtesting i hjemmebur hos rotter⁸. Hvis testingen er atskilt med lange perioder (mer enn 2-3 uker), må dyrene tilvennes igjen. For gjentatt tilvenning er minst en til to forsøk tilstrekkelig. Men hvis temperaturtester er atskilt med mer langvarige anfall av tid, kan det være nødvendig å gjenta flere forsøk.

I den fortsatte innsatsen for å venne mus og rotter til testprosedyren, bør en akklimatiseringsperiode før stimuluspresentasjon inkluderes i hver eksperimentell studie. Denne akklimatiseringstiden er avgjørende for å balansere temperatur og aktivitet etter å ha blitt flyttet til teststedet. Gnagere har en tendens til å ha skarpe temperaturøkninger på grunn av translokasjon. Akklimatisering bør bestå av minst 1 time uten interaksjon fra eksperimentøren på testdagen før tilsetning av farmakologisk middel eller kontekstuelle stimuli. Dette er nødvendig hver dag med testing.

I de skisserte temperaturtestene for hjemmebur har mus fri rekkevidde av hjemmeburet til å streife rundt som svar på den testede stimulansen. Dette kan forårsake variable skift i aktivitet, noe som påvirker nøyaktigheten av temperaturavlesninger og dermed analysen av de termogene effektene av den uavhengige variabelen (f.eks. Farmakologisk eller kontekstuell stimulus). I anerkjennelse av de potensielle temperaturendringene på grunn av aktivitetsnivå, er en protokoll inkludert nedenfor som beskriver bruken av temperatur under tredemøllevandring. Den publiserte litteraturen beskriver vellykket bruk av denne prosedyren hos rotter, og den brukes for tiden med mus 8,10,14,15. Tredemølle gange opprettholder en konstant aktivitetshastighet for testpersonen. For denne studien er tredemøller strengt brukt til å kontrollere aktivitetsnivået og er derfor satt til laveste tilgjengelige hastighet på tredemølle for å fremme gange for mus og en tilsvarende lav innstilling for rotter.

Følgende prosedyre er skissert for temperaturmåling av ensidig gastrocnemius hos mus og rovdyr luktpresentasjon. Designet kan brukes sammen med farmakologiske midler og er overførbart til rotter og andre skjelettmuskelgrupper (dvs. quadriceps) hos mus. For rotter kan transpondere plasseres i gastrocnemius bilateralt og i brunt fettvev. På grunn av størrelses- og avstandsbegrensninger kan bare en transponder brukes per mus. Mindre modifikasjoner (f.eks. fjerning av kontekstuelle stimuli) kan gjøres for å vurdere termogene responser på farmakologiske midler.

Protocol

Disse metodene kan brukes på både rotte- og musemodeller og ble utført med institusjonell godkjenning (Kent State University, IACUC Approval # 359 og # 340 CN 12-04). Før protokollen iverksettes, skal dyr innkvarteres i samsvar med Veiledningen for stell og bruk av forsøksdyr. 1. Forbereder transponderleseren MERK: Før bruk må transponderleseren stilles inn; Følgende trinn inkluderer bare innstillingsendringene som er nødvendige for…

Representative Results

Transpondere ble ensidig implantert i høyre gastrocnemius av ti 4-6 måneder gamle, villtype (WT) mus oppdrettet fra SF1-Cre-stammen (Tg(Nr5a1-cre)7Lowl/J, stamme #012462, C57BL/6J og FVB-bakgrunn; kvinne N = 5; hann N = 5). Etter utvinning ble musene habituert til en hjemmeburtemperatur-testprosedyre som ikke inkluderte en kontekstuell stimulus (f.eks. PO). Temperaturmålinger ved hjelp av en transponderstav ble registrert i deres boligrom og etter overføring til teststedet. Mus ble gitt 1-2 timer for å akklimatisere…

Discussion

Denne temperaturtestingsprotokollen gir feltet en avenue for å måle skjelettmuskulaturtermogenese direkte. Dette er kritisk ettersom forskning dykker ned i å identifisere mekanismene som ligger til grunn for muskeltermogenese³³. Metoden gir to kostnadseffektive protokoller for måling av skjelettmuskulaturtermogenese under kontekstuelle og farmakologiske forhold. Denne protokollen understreker viktigheten av både tilvenning og akklimatisering innenfor disse prosedyrene. Habituation brukes til …

Materials

1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock	Columbus Instruments
1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock	Columbus Instruments
1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter	BrassCraft
1 mL Syringes	Fisher Scientific	BD 309659
Betadine Swabs	Fisher Scientific	19-898-945
Booster Coil	BioMedic Data Systems		Transponder Accessory
Electric Clippers	Andis		40 Ultraedge Clipper Blade
Flexible Mirror Sheets	Amazon		Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles
Forceps	Fisher Scientific	89259-940
Heating Pad
Induction Chamber (isoflurane)	Kent Scientific	VetFlo-0730	3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers
Ketoprophen	Med-Vet Intl.	RXKETO-50
Magnetic Strips	Amazon
Magnets	Amazon		DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs
Needles	Med-Vet Intl.	26400
Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g	Med-Vet Intl.	RXNPB-HC
Oasis Absorbable Suture	Med-Vet Intl.	MV-H821-V
Predator (Ferret) Odor Towels	Marshall BioResources
PVC pipe
Reflex Wound Clip Remover	CellPoint Scientific
Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse)	CellPoint Scientific
Reflex Wound Clip, 9 mm (rat)	CellPoint Scientific
Srerile Autoclip, 7 mm (mouse)	CellPoint Scientific		Wound Clip Applier (mouse)
Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser	Amazon
Sterile Autoclip, 9 mm (rat)	CellPoint Scientific		Wound Clip Applier (rat)
Sterile Saline	Med-Vet Intl.	RX0.9NACL-10
Surgical Scissors	Fisher Scientific	08-951-5
Surgical Sheets
Towels (Control/Habituation)	Amazon		100% Cotton Towels, white
Transponders	BioMedic Data Systems		Model: IPTT-300
Transponders Reader	BioMedic Data Systems		Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R
Versaclean	Fisher Scientific	18-200-700	liquid detergent
Webcol Alcohol Preps	Covidien	22-246-073
Wedge pieces for PVC pipe