Misurazione della termogenesi del muscolo scheletrico in topi e ratti

Summary

Topi e ratti vengono impiantati chirurgicamente con transponder di temperatura remoti e quindi abituati all’ambiente e alla procedura di test. Le variazioni della temperatura muscolare vengono misurate in risposta a stimoli farmacologici o contestuali nella gabbia domestica o durante l’attività fisica prescritta (ad esempio, tapis roulant che cammina a velocità costante).

Abstract

La termogenesi del muscolo scheletrico fornisce una potenziale strada per comprendere meglio l’omeostasi metabolica e i meccanismi alla base del dispendio energetico. Sorprendentemente poche prove sono disponibili per collegare i meccanismi neurali, miocellulari e molecolari della termogenesi direttamente ai cambiamenti misurabili della temperatura muscolare. Questo articolo descrive un metodo in cui i transponder di temperatura vengono utilizzati per recuperare misurazioni dirette della temperatura del muscolo scheletrico del topo e del ratto.

I transponder remoti vengono impiantati chirurgicamente all’interno del muscolo di topi e ratti e agli animali viene dato il tempo di riprendersi. Topi e ratti devono quindi essere ripetutamente abituati all’ambiente e alla procedura di test. I cambiamenti nella temperatura muscolare sono misurati in risposta a stimoli farmacologici o contestuali nella gabbia domestica. La temperatura muscolare può anche essere misurata durante l’attività fisica prescritta (cioè il tapis roulant che cammina a velocità costante) per tenere conto dei cambiamenti nell’attività come contributori ai cambiamenti nella temperatura muscolare indotti da questi stimoli.

Questo metodo è stato utilizzato con successo per chiarire i meccanismi alla base del controllo termogenico muscolare a livello del cervello, del sistema nervoso simpatico e del muscolo scheletrico. Vengono fornite dimostrazioni di questo successo utilizzando l’odore del predatore (PO; odore di furetto) come stimolo contestuale e iniezioni di ossitocina (Oxt) come stimolo farmacologico, dove l’odore del predatore induce la termogenesi muscolare e Oxt sopprime la temperatura muscolare. Pertanto, questi set di dati mostrano l’efficacia di questo metodo nel rilevare rapidi cambiamenti nella temperatura muscolare.

Introduction

Nell’ambito della ricerca metabolica, l’esame della termogenesi del muscolo scheletrico è una nuova strada promettente per sondare l’omeostasi del peso corporeo. La letteratura pubblicata supporta l’idea che le risposte termogeniche di uno dei più grandi sistemi di organi del corpo, il muscolo scheletrico, forniscano una strada per aumentare il dispendio energetico e altri effetti metabolici, riequilibrando così efficacemente i sistemi all’interno di malattie come l’obesità ^1,2,3. Se il muscolo può essere considerato un organo termogenico, gli studi devono utilizzare una metodologia pratica per studiare i cambiamenti termogenici all’interno di questo organo. Il desiderio di comprendere l’impatto endotermico dei muscoli scheletrici e l’utilità di questa metodologia per studiare la termogenesi muscolare non tremante non sono specifici degli studi metabolici. Discipline tra cui l’evoluzione⁴, la fisiologia comparata⁵ e l’ecofisiologia ^6,7 hanno mostrato un interesse acquisito nella comprensione dei modi in cui la termogenesi muscolare può contribuire all’endotermia e come questo meccanismo si adatta all’ambiente. Il protocollo presentato fornisce i metodi critici necessari per affrontare queste domande.

Il metodo fornito può essere utilizzato nella valutazione della modulazione degli stimoli sia contestuali che farmacologici della temperatura muscolare, compresa la tecnica unica di fornire odore predatore (PO) per spostare il contesto per replicare la minaccia del predatore. Rapporti precedenti hanno dimostrato la capacità di PO di indurre rapidamente un aumento considerevole della termogenesi muscolare⁸. Inoltre, gli stimoli farmacologici possono anche alterare la temperatura muscolare. Ciò è stato dimostrato nel contesto della termogenesi muscolare indotta da PO, dove il blocco farmacologico dei recettori periferici β-adrenergici, utilizzando nadololo, ha inibito la capacità di PO di indurre la termogenesi muscolare senza influenzare significativamente la termogenesi contrattile durante la camminata sul tapis roulant⁸. La somministrazione centrale di agonisti del recettore della melanocortina nei ratti è stata utilizzata anche per discernere i meccanismi cerebrali che alterano la termogenesi ^9,10.

Fornito qui è un’indagine preliminare sulla capacità del neuroormone ossitocina (Oxt) di alterare la termogenesi muscolare nei topi. Simile alla minaccia dei predatori, gli incontri sociali con un conspecifico dello stesso sesso aumentano la temperatura corporea, un fenomeno indicato come ipertermia sociale¹¹. Data la rilevanza di Oxt per il comportamento sociale¹², è stato ipotizzato che Oxt sia un mediatore dell’ipertermia sociale nei topi. Infatti, un antagonista del recettore dell’ossitocina diminuisce l’ipertermia sociale nei topi¹¹ e i cuccioli di topo privi di Oxt mostrano deficit negli aspetti comportamentali e fisiologici della termoregolazione, inclusa la termogenesi¹³. Dato che Harshaw et al. (2021) non hanno trovato prove a sostegno della termogenesi del tessuto adiposo bruno (BAT) dipendente dal recettore β3 con ipertermia sociale¹¹, è stato ipotizzato che l’ipertermia sociale possa essere guidata dall’induzione della termogenesi muscolare da parte di Oxt.

Per misurare la termogenesi del muscolo scheletrico, il seguente protocollo utilizza l’impianto di transponder IPTT-300 preprogrammati adiacenti al muscolo di interesse all’interno di un topo o ratto 8,10,14,15. Questi transponder sono microchip incapsulati in vetro che vengono letti utilizzando i corrispondenti lettori di transponder. Poca o nessuna ricerca ha utilizzato questa tecnologia in questa capacità, anche se gli studi hanno suggerito la necessità della specificità fornita da questo metodo^16,17. Precedenti indagini hanno dimostrato l’affidabilità di questo metodo e vari modi in cui i transponder di temperatura possono essere utilizzati rispetto ad altri metodi di prova della temperatura¹⁸ o in combinazione con metodi chirurgici (ad esempio, incannulamento¹⁹). Tuttavia, studi di questa natura si basano su diversi posizionamenti strategici per misurare la temperatura corporea complessiva 20,21,22 o tessuti specifici come BAT^23,24,25.

Piuttosto che misurare la temperatura da queste posizioni o durante l’utilizzo di termometri auricolari o rettali²⁶, il metodo qui descritto fornisce specificità per il muscolo di interesse. La capacità di indirizzare un sito impiantando direttamente transponder adiacenti ai muscoli di interesse è più efficace per sondare specificamente la termogenesi muscolare. Fornisce una nuova strada oltre a quelle fornite dalla termometria infrarossa superficiale ^27,28 o dalle misurazioni della temperatura cutanea tramite termocoppia ²⁹. Inoltre, i dati forniti attraverso questo metodo offrono una gamma di percorsi di ricerca, evitando la necessità di apparecchiature e software ad alta tecnologia di grandi dimensioni, costosi e ad alta tecnologia come la termografia a infrarossi^30,31,32.

Questo metodo è stato utilizzato con successo per misurare la temperatura nel quadricipite e nel gastrocnemio, unilateralmente o bilateralmente. Questo metodo è stato efficace anche in combinazione con la chirurgia stereotassica^14,15. Entro ~ 7-10 cm dall’arto del transponder, i lettori transponder portatili (DAS-8027 / DAS-7007R) vengono utilizzati per scansionare, misurare e visualizzare la temperatura. Questa distanza è stata critica e preziosa per le indagini precedenti ^8,9,10 perché riduce al minimo i potenziali fattori di stress e le variabili che alterano la temperatura come la manipolazione degli animali durante le procedure di test. Utilizzando i timer, le misurazioni possono quindi essere registrate e raccolte per un periodo di tempo senza interazione diretta con gli animali.

Per ridurre ulteriormente il disturbo dei topi durante i test, questo metodo descrive l’assemblaggio e l’uso di riser realizzati con tubazioni in PVC per dare allo sperimentatore l’accesso al fondo delle gabbie domestiche durante i test. Utilizzando i riser in tandem con il lettore digitale, le misurazioni della temperatura dell’arto del transponder possono essere effettuate senza alcuna interazione animale dopo che lo stimolo è stato posizionato. A un costo minimo, questo metodo può essere utilizzato in combinazione con stimoli farmacologici e contestuali, rendendolo abbastanza accessibile per i ricercatori. Inoltre, questo metodo può essere impiegato con un numero considerevole di soggetti (~ 16 topi o ~ 12 ratti) alla volta, risparmiando tempo nell’aumentare il throughput complessivo per qualsiasi progetto di ricerca.

Introdotto in questo metodo è un meccanismo artigianale per presentare gli odori ai topi utilizzando palline di infusore di tè in rete di acciaio inossidabile, d’ora in poi denominate “palline di tè”. Sebbene queste palline di tè siano ideali per contenere qualsiasi materiale odoroso, in questi studi, gli asciugamani che sono serviti come biancheria da letto in gabbia per 2-3 settimane per i furetti, un predatore naturale di topi e ratti, sono collocati all’interno di ogni pallina da tè di trattamento. Ogni asciugamano è tagliato in quadrati di 5 cm x 5 cm. Questa aliquotazione viene ripetuta anche con asciugamani di controllo altrimenti identici inodori. Presentare questi odori senza una barriera (cioè una pallina di tè) ha portato i topi a distruggere le fibre all’interno delle loro gabbie, aumentando l’attività fisica. Questo comportamento non era così saliente nei ratti. Le palline di tè forniscono un involucro ventilato all’asciugamano, dando pieno accesso all’odore pur rimanendo protetti per l’intera prova sperimentale. Queste palline di tè possono essere sanificate secondo i protocolli di utilizzo degli animali, preparate e introdotte direttamente dopo l’intervento chirurgico per iniziare ad abituare gli animali alla struttura insieme allo stimolo di controllo. I topi possono quindi vivere con l’arricchimento aggiuntivo, diminuendo la salienza della presentazione dello stimolo acuto.

L’abitudine alla presenza della pallina da tè è solo un aspetto dell’assuefazione che è fondamentale per questo metodo. Il protocollo di assuefazione descritto consiste anche nell’esposizione ripetuta alla procedura di test per normalizzare l’ambiente di test (cioè personale, trasporto e spostamento verso il luogo del test, esposizione allo stimolo). Questa assuefazione prolungata riduce al minimo le risposte sfumate degli animali e concentra le misurazioni sulle variabili dipendenti desiderate (ad esempio, stimoli farmacologici o contestuali). La precedente valutazione di questo protocollo ha identificato quattro prove come il numero minimo di assuefazioni necessarie prima del test della temperatura all’interno delle gabbie domestiche nei ratti⁸. Se il test è separato da lunghi periodi (più di 2-3 settimane), gli animali devono essere nuovamente abituati. Per l’assuefazione ripetuta, sono sufficienti almeno una o due prove. Tuttavia, se i test di temperatura sono separati da periodi di tempo più prolungati, potrebbe essere necessario ripetere più prove.

Nel continuo sforzo di abituare topi e ratti alla procedura di test, un periodo di acclimatazione prima della presentazione dello stimolo dovrebbe essere incluso in ogni prova sperimentale. Questo tempo di acclimatazione è fondamentale per riequilibrare la temperatura e l’attività dopo essere stati spostati nel luogo di test. I roditori tendono ad avere forti aumenti di temperatura dovuti alla traslocazione. L’acclimatazione dovrebbe consistere in un minimo di 1 ora senza interazione da parte dello sperimentatore il giorno della prova prima di qualsiasi aggiunta di un agente farmacologico o stimoli contestuali. Questo è necessario ogni giorno di test.

Nei test di temperatura della gabbia domestica delineati, i topi hanno il campo libero della loro gabbia domestica per vagare in risposta allo stimolo testato. Ciò può causare cambiamenti variabili nell’attività, influenzando l’accuratezza delle letture della temperatura e, quindi, l’analisi degli effetti termogenici della variabile indipendente (ad esempio, stimolo farmacologico o contestuale). In riconoscimento dei potenziali cambiamenti di temperatura dovuti al livello di attività, un protocollo è incluso di seguito che descrive l’uso della temperatura durante la camminata sul tapis roulant. La letteratura pubblicata descrive l’uso efficace di questa procedura nei ratti ed è attualmente impiegata con topi 8,10,14,15. La camminata sul tapis roulant mantiene una velocità costante di attività per il soggetto del test. Per questo studio, i tapis roulant sono rigorosamente utilizzati per controllare il livello di attività e, pertanto, sono impostati sulla velocità più bassa disponibile sul tapis roulant per promuovere la camminata per i topi e un’impostazione altrettanto bassa per i ratti.

La seguente procedura è descritta per la misurazione della temperatura del gastrocnemio unilaterale nei topi e la presentazione degli odori dei predatori. Il disegno può essere utilizzato in combinazione con agenti farmacologici ed è trasferibile ai ratti e ad altri gruppi muscolari scheletrici (cioè quadricipiti) nei topi. Per i ratti, i transponder possono essere posizionati nel gastrocnemio bilateralmente e nel tessuto adiposo bruno. A causa dei limiti di dimensioni e distanza, è possibile utilizzare un solo transponder per mouse. Modifiche minori (ad esempio, la rimozione di stimoli contestuali) possono essere apportate per valutare le risposte termogeniche agli agenti farmacologici.

Protocol

Questi metodi possono essere applicati sia a modelli di ratto che di topo e sono stati eseguiti con l’approvazione istituzionale (Kent State University, IACUC Approval #359 e #340 CN 12-04). Prima dell’attuazione del protocollo, gli animali devono essere alloggiati in conformità con la Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. 1. Preparazione del lettore di transponder NOTA: Prima dell’uso, il lettore del transponder deve esse…

Representative Results

I transponder sono stati impiantati unilateralmente nel gastrocnemio destro di dieci topi wild-type (WT) di 4-6 mesi allevati dal ceppo SF1-Cre (Tg(Nr5a1-cre)7Lowl/J, ceppo #012462, C57BL/6J e background FVB; femmina N = 5; maschio N = 5). Dopo il recupero, i topi sono stati abituati a una procedura di test della temperatura della gabbia domestica che non includeva uno stimolo contestuale (ad esempio, PO). Le misurazioni della temperatura utilizzando una bacchetta transponder sono state registrate all’interno della loro …

Discussion

Questo protocollo di test della temperatura fornisce al campo una strada per misurare direttamente la termogenesi del muscolo scheletrico. Questo è fondamentale in quanto la ricerca approfondisce l’identificazione dei meccanismi alla base della termogenesi muscolare³³. Il metodo fornisce due protocolli economici per misurare la termogenesi del muscolo scheletrico in condizioni contestuali e farmacologiche. Questo protocollo sottolinea l’importanza sia dell’assuefazione che dell’acclimatazione all…

Materials

1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock	Columbus Instruments
1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock	Columbus Instruments
1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter	BrassCraft
1 mL Syringes	Fisher Scientific	BD 309659
Betadine Swabs	Fisher Scientific	19-898-945
Booster Coil	BioMedic Data Systems		Transponder Accessory
Electric Clippers	Andis		40 Ultraedge Clipper Blade
Flexible Mirror Sheets	Amazon		Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles
Forceps	Fisher Scientific	89259-940
Heating Pad
Induction Chamber (isoflurane)	Kent Scientific	VetFlo-0730	3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers
Ketoprophen	Med-Vet Intl.	RXKETO-50
Magnetic Strips	Amazon
Magnets	Amazon		DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs
Needles	Med-Vet Intl.	26400
Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g	Med-Vet Intl.	RXNPB-HC
Oasis Absorbable Suture	Med-Vet Intl.	MV-H821-V
Predator (Ferret) Odor Towels	Marshall BioResources
PVC pipe
Reflex Wound Clip Remover	CellPoint Scientific
Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse)	CellPoint Scientific
Reflex Wound Clip, 9 mm (rat)	CellPoint Scientific
Srerile Autoclip, 7 mm (mouse)	CellPoint Scientific		Wound Clip Applier (mouse)
Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser	Amazon
Sterile Autoclip, 9 mm (rat)	CellPoint Scientific		Wound Clip Applier (rat)
Sterile Saline	Med-Vet Intl.	RX0.9NACL-10
Surgical Scissors	Fisher Scientific	08-951-5
Surgical Sheets
Towels (Control/Habituation)	Amazon		100% Cotton Towels, white
Transponders	BioMedic Data Systems		Model: IPTT-300
Transponders Reader	BioMedic Data Systems		Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R
Versaclean	Fisher Scientific	18-200-700	liquid detergent
Webcol Alcohol Preps	Covidien	22-246-073
Wedge pieces for PVC pipe