Summary
移植由神经元编程产生的人类多能干细胞衍生的GABA能神经元可能是神经发育障碍的潜在治疗方法。该协议描述了人类干细胞来源的GABA能神经元前体的产生和移植到新生小鼠的大脑中,允许对移植神经元进行长期研究并评估其治疗潜力。
Abstract
抑制性中间神经元的数量减少或功能障碍是神经发育障碍的常见因素。因此,使用中间神经元来替代或减轻改变的神经元回路影响的细胞疗法是一种有吸引力的治疗途径。为此,需要更多关于人类干细胞衍生的GABA能神经元间样细胞(hdINs)如何随着时间的推移在宿主回路中成熟,整合和功能的知识。在神经发育障碍中,特别重要的是更好地了解移植细胞中的这些过程是否受到进化和成熟的宿主大脑的影响。本协议描述了基于转录因子 Ascl1 和 Dlx2的转基因表达从人类胚胎干细胞中快速有效地生成hdIN。这些神经元前体在 体外7天后单侧移植到新生儿2天龄小鼠的海马体中。移植的神经元分散在皮质发育不良局灶性癫痫综合征小鼠模型的同侧和对侧海马体中,并在移植后存活长达 9 个月。这种方法允许研究移植中间神经元在发育健康和患病大脑中的细胞身份、整合、功能和治疗潜力。
Introduction
神经元网络的建立、成熟和完善发生在围产期和产后早期,是大脑发育的关键时间窗口1。从出生后丰富的连接性,大脑进化到对连接的微调,一直延伸到青春期2。因此,在这些时期表达的基因的改变,以及外部因素或侮辱,定义了个体对多种神经发育障碍的易感性。认知和运动功能的损害随着时间的推移而发展,药物治疗受到限制,大多数针对具有严重副作用风险的症状。
γ-氨基丁酸 (GABA) 能抑制功能障碍已被证明是各种神经发育障碍3 的根本原因的主要原因,例如脆性 X 综合征、安格曼综合征、癫痫、精神分裂症和自闭症。GABA 是中枢神经系统的主要抑制递质,有助于维持兴奋性/抑制性 (E/I) 平衡、神经元放电的同步和计算。GABA能中间神经元是神经元的异质群体,在更复杂的大脑区域4和进化5,6中具有越来越多的功能复杂性。考虑到人脑有限的内源性再生能力以及中间神经元功能障碍在几种神经系统疾病中的影响,GABA能中间神经元的移植可能是一种有前途的治疗途径。沿着这条线,与啮齿动物同种异体神经元前体或其他地方使用的其他来源相比,人类干细胞衍生的GABA能神经元间样细胞(hdINs)似乎是为此目的最具转化性和可行性的来源7。从不同细胞来源产生GABA能神经元的方案可用8,9,10,11,12,13,但需要更多关于hdIN如何随着时间的推移在发育中的病理大脑中成熟,整合和功能的知识。一些研究已经确定了在皮质模式期间活跃的基因的改变,建立了神经元连接14,并调整了生理E / I平衡15。新生儿将hdINs移植到具有相应遗传扰动的小鼠模型中,使我们能够跟踪宿主和移植物之间的相互作用,这是确定潜在治疗策略所必需的知识。
免疫调节通常用于异种移植,以避免触发宿主免疫反应和排斥反应16。然而,免疫抑制药物(如环孢素A)的给药在长期给药后引起肾毒性,由于需要每天腹膜内注射以达到稳定的全身浓度,因此是劳动密集型的,引起动物应激17,并且具有可与病理相互作用的脱靶效应18。此外,损害免疫系统已被证明会改变行为表型19,并改变相应的神经解剖区域20。在出生后第一周进行移植已被证明可以适应移植的细胞21,22,而其他人则报告了初始存活率,然后在出生后第一个月内排斥移植物23,24。
该协议描述了从hdIN生成到新生小鼠细胞移植的程序,导致长期移植物存活,并允许研究生理和病理发育过程中移植的人中间神经元的神经元特异性,突触整合,功能和治疗潜力。
Protocol
所有实验程序均由马尔默/隆德动物研究伦理委员会批准,伦理许可证号为12548-19,并按照瑞典动物福利局法规和欧盟动物实验指令2010/63 / EU进行。在本研究的出生后第2天,使用C57BL6 / J和 接触蛋白相关蛋白样2 (Cntnap2)敲除(KO)小鼠,包括雄性和雌性。使用人类胚胎干细胞(hESCs)。动物和干细胞是从商业来源获得的(见 材料表)。
1. HDIN前体的产生
注意:本节中的所有步骤都是在细胞培养罩中完成的。使用干细胞培养基将hESCs维持在包被板上的无饲养层细胞上,并作为菌落传代。
- 对hESC进行到hdIN前体的前向编程(图1)。
注:前向规划方法基于Gonzalez-Ramos等人8和 Yang等人9中描述的过程。- 在含有10μMROCK抑制剂(RI)的新鲜干细胞培养基中,用含有Tet-On系统的慢病毒载体转导hESC(参见 材料表)。在培养箱中保持在37°C。
- 转导后16小时将培养基更换为新鲜干细胞培养基,并以与非转导hESC相同的方式维持转导的细胞。
- 汇合时,使用细胞分离溶液(参见 材料表)将hESC分离为单细胞,并将它们以3 x 105个细胞 /孔的密度接种在含有10μMRI的干细胞培养基中的包被的6孔板中体 外 (DIV)-1。
- 在 1 div 时,用含有 2 g/L 多西环素的 N2 培养基替换培养基(DOX,参见 材料表)。
注意:DOX用于诱导Ascl1和Dlx29的转基因表达,从1 DIV到7 DIV,然后通过将其添加到饮用水25中继续体内。 - 在2 DIV时,抗生素耐药性选择期开始,将持续到5 DIV。 将嘌呤霉素(puro)和潮霉素(潮)添加到新鲜培养基中(见 材料表)。更换 2 分区、4 分区和 5 分区的介质。
注意:使用转导和非转导的hESC在分化方案之前优化puro和潮液的浓度,以确保仅携带抗生素耐药盒的细胞存活。在该方案中,使用了 0.5 μg/mL 的 puro 和 750 μg/mL 的湿润液。 - 在 5 DIV,抗生素选择期结束。改用补充有2g / LDOX和4μM胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(Ara-C,见 材料表)的N2培养基。
图1:通过过表达Ascl1和Dlx2从hESC产生hdIN前体。(A) 用于生成hdIN前体的分化方案示意图。(乙-E)(B)神经元标志物MAP2,(C)增殖标志物Ki67,(D)一般核染色和(E)先前标志物的合并,在7 DIV下hdIN前体的免疫细胞化学。比例尺:50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
2.移植用单细胞悬液的制备
注意:本节中的所有步骤都在细胞培养罩中完成。在7 DIV上,hdIN前体被解离并用于移植。
- 按照以下步骤执行细胞分离。
- 取出培养基,用不含钙和镁的DPBS仔细冲洗细胞。
- 向 6 孔板的每个孔中加入 400 μL 细胞分离溶液(参见 材料表)。
注意:确保溶液覆盖整个表面。 - 在培养箱中于37°C孵育2-3分钟,直到细胞的边界开始看起来有光泽,表明细胞表面蛋白的酶降解并从孔表面分离。
注意:为了提高细胞存活率,当所有细胞完全分离并漂浮时,不要等待太久。 - 然后,向 6 孔板的每个孔中加入 600 μL 新鲜 N2 培养基以停止酶,并用移液器机械地帮助分离细胞以获得单细胞悬液。
- 将细胞悬液转移到塑料管(15mL)中,并在室温(RT)下以180× g 离心4分钟。
- 对细胞进行重悬。
- 使用真空系统(小心,在不干扰沉淀的情况下)弃去上清液,并将沉淀重悬于含有 10 μM RI、1 μg/mL 脱氧核糖核酸酶和 2 μg/μL DOX 的移植培养基中。
- 使用计数室和手动细胞计数器计数悬浮液中的总细胞,并将体积调节至100,000个细胞/μL的最终浓度。
- 将细胞悬液保持在冰上的封闭管中,直到移植最多4小时。
注意:移植必须在制备细胞悬液(7 DIV)的同一天进行。
3.海马内细胞移植
注意:本节中的所有步骤均在动物设施的细胞培养罩外进行。在P2上进行早期产后细胞移植到大脑中,考虑到P0是出生当天。
- 按照以下步骤准备移植实验。
- 高压灭菌所有手术材料,如果不可能,则用另一种批准的方法灭菌。
- 将注射器安装在支架中,没有任何玻璃毛细管。用水冲洗针头。
注意:针头必须为 33 克。 - 弯曲90°30 G胰岛素针尖。
- 创建一个自制的类似橡皮泥的舞台,用于将幼犬的头部平放(图 2A)。
- 在为手术准备任何东西之前,先将老鼠笼子与母亲和幼崽一起取出,让它们适应新环境。
- 准备一个装有湿冰的托盘和一个装有一些纸的空笼子,用于异氟醚。
- 麻醉小鼠幼崽。
- 用异氟醚浸泡一张纸(见 材料表),然后将其放入空笼子内。小心地取一只小狗,将其放入浸泡在异氟醚中的纸的笼子中。
注意:切勿与妈妈一起留下少于三只幼崽。不要超过20-30秒的异氟醚麻醉,否则幼崽可能会死亡。 - 通过停止运动来验证麻醉的效果。
- 麻醉后立即将幼犬放在湿冰表面上的湿纸巾上。将动物放在冰上3分钟,直到上肢变白(图2B,蓝色箭头)。这通常需要2-3分钟。
- 利用这段时间用细胞悬液装载注射器。之前用移液管小心地重悬细胞。
- 将小狗放在立体定位框架上。以相反方向使用耳条(图2A,洋红色箭头)。
注意:耳条的背面不那么尖,由于 P2 幼犬没有耳朵,请使用较平坦的一面以避免伤害动物。 - 从侧面检查头部是否笔直。头部必须平坦;使用类似Play-Doh的舞台来调整这一点。
注意:这个年龄段的幼崽还没有睁开眼睛,所以在这方面不需要做额外的步骤。幼崽在这个年龄没有皮毛,因此不需要剃须。没有给予特定的疼痛治疗,因为它不是皮肤的开放切口,也不涉及缝合。 - 在整个手术过程中,将幼犬盖在冰上(在薄纸上)。
注意:请勿将冰块与幼犬的皮肤直接接触。
- 用异氟醚浸泡一张纸(见 材料表),然后将其放入空笼子内。小心地取一只小狗,将其放入浸泡在异氟醚中的纸的笼子中。
- 进行注射。
- 使用浸泡在乙醇中的软组织清洁皮肤表面。
- 识别λ并在立体定位仪器的数字显示控制台上将坐标设置为零(图2C,黄色虚线)。矢状缝合线和λ样缝合线很容易被眼睛看到,因为它们是血管化的,如红线。
注意:如果在可视化λ时遇到困难,请在皮肤上放一小块冰,等待几分钟让它冷却下来。然后,移开冰块,皮肤的微妙美白将让您可视化。 - 将注射针重新定位到所需的坐标。在所描述的方案中,目标区域是海马体,坐标如下:前后(AP)+0.85和中外侧(ML)+1.35。
- 使用90°弯曲的胰岛素针穿透颅骨并形成一个小孔。
- 放下注射针,直到它穿过颅骨,并将背腹(DV)坐标归零。降低针头,直到达到所需的DV坐标。在所描述的协议中,坐标为DV −1.1。
- 根据预定的时间间隔注射。
注意:在所描述的方案中,确切的时间如下:(i)下降到DV坐标后,等待3分钟,(ii)注入1μL体积5分钟,以及(iii)在所有体积注入后,等待3分钟。 - 慢慢缩回针头。
- 结束该过程。
注意:手术不能持续超过 15 分钟,以确保幼犬的存活并避免体温过低对麻醉造成的任何损害。- 用手加热小狗,直到它开始移动,然后再把它还给母亲。
- 在移植前和移植后 (PT) 至少 2 天和移植后 3 周,在 0.5% 蔗糖溶液中以 1 mg/mL 的浓度给予 DOX,以继续 体内细胞分化。
图2:P2处新生小鼠幼崽的立体定位移植。 (A)一个类似橡皮泥的舞台,用于将幼犬的身体固定在适当的位置和倒置的耳条(洋红色箭头)。(B)白色前爪(蓝色箭头)表示该区域的血流量减少,因此幼崽正在经历体温过低的麻醉。(C)小狗已经在软纸上被冰覆盖的设置概述。(C#)小狗头部的闭合变焦,注射针已经插入大脑(黄色虚线表示λ和λ缝合线)。该图改编自冈萨雷斯·拉莫斯等人。27. 请按此查看本图的大图。
Representative Results
按照此处介绍的方案并如图1A所示,hdIN前体在7 DIV下尚未增殖,如(i)细胞周期标志物Ki67的阴性免疫反应性和(ii)表达神经元标志物,如微管相关蛋白2(MAP2)(图1B-E)。在经历所有程序步骤后,对重新铺板24小时的剩余细胞进行该表征。此外,之前发表的基因表达分析表明,从多能状态到神经元表型的快速转变发生在4 DIV和7 DIV8左右。总体而言,这些结果证实了有丝分裂后细胞的存在,并且不存在畸胎瘤形成的风险。
接下来,通过免疫组织化学对人细胞质标志物STEM121进行免疫组化测试hdIN前体在出生后早期移植到野生型(WT)小鼠海马体后的存活率。将hdIN前体移植到P2处幼稚免疫功能小鼠的右背海马体中,然后在P14和PT处死2个月。 在整个背侧海马体中发现移植细胞,并在两个时间点通过胼胝体和对侧海马体分散。此外,在两个时间点,嫁接的hdIN表达Ascl1,这是诱导转录因子之一(补充图1),并且不增殖,如Ki67表达缺失所示(补充图2)。
重要的是,在P14或2个月PT时均未发现针对移植细胞的免疫反应或局部炎症,这是通过使用Iba1,CD68和半乳糖凝集素-3(Gal3)鉴定的反应性小胶质细胞的缺失来评估的(图3),由神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和炎性细胞因子(如白细胞介素-1(IL-1))确定的星形胶质细胞增生的程度, 以及缺乏细胞毒性T淋巴细胞(CD8)(图4)。
图 3:P14 和 2 个月 PT 处的 hdINs 进入新生 WT 小鼠的海马体,而不会触发宿主组织的免疫排斥反应。脑组织中 Iba1、CD68 和 Gal3 标志物的免疫荧光来自电凝中风小鼠模型中缺血核心区域的接近程度(阳性对照,Ctrl +)、(E-H) 阴性对照动物 (Ctrl-) 2 个月和 (M-P) P14,以及 (I-L) 在 2 个月时接受细胞移植的动物和 (Q-T第14页。白色箭头表示由于自发荧光在所有通道上可见的血管的一些示例。缩写:Ctx = 皮层;髋关节=海马体;DG = 齿状回;CA1 = 角氨 1。比例尺:50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:2 个月 PT 时的 hdINs 进入新生 WT 小鼠的海马体,而不会触发宿主组织的免疫排斥反应。脑组织中IL1,GFAP和CD8标志物的免疫荧光来自(A-D)电凝中风小鼠模型中缺血核心区域的邻近性(阳性对照,Ctrl +),(E-H)阴性对照动物(Ctrl-)在2个月时,和(I-L)在2个月时接受细胞移植的动物。缩写:Ctx = 皮层;髋关节=海马体;DG = 齿状回。比例尺:50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
同样,hdIN前体也被移植到Cntnap2 KO小鼠的海马体中,这是自闭症谱系障碍和皮质发育不良 - 局灶性癫痫综合征的模型。事实上,在Cntnap2 KO小鼠中,hdINs存活了长达9个月的PT并定位在注射部位,尽管它们也分散在同侧甚至对侧海马体中,如在WT小鼠中观察到的那样(图5)。此外,大多数移植的hdINs对中间神经元标志物具有免疫反应性,正如先前体外8,26和成年啮齿动物体内25的结果所预期的那样。
图 5:9 个月 PT 时 Cntnap2 KO 小鼠海马体中的移植 hdIN。 (A)细胞移植(左)和假(右)小鼠中针对细胞质人标记物STEM121的免疫化学。(A1 和 A2)STEM121阳性细胞的放大图像。(B)STEM121(洋红色)和中间神经元标志物小白蛋白(PV)和生长抑素(SST)的免疫荧光。白色箭头表示STEM121的双阳性细胞和相应的中间神经元标记。(C)移植的HDIN对STEM121和PV免疫反应的正交视图。比例尺:200 μm(A 和 B)、100 μm(a1 和 a2)、20 μm(a1 和 a2 以及 C 中的小方形放大倍率)。请点击此处查看此图的大图。
补充图1:2个月PT时将hdIN移植到表达Ascl1的新生WT小鼠的海马体中。 在细胞移植的WT小鼠中,针对(A)CA3和(B)DG处的Ascl1和细胞质人标记物STEM121的免疫荧光。(a) STEM121阳性细胞的放大图像。白色箭头表示STEM121和Ascl1的双阳性细胞。比例尺:100 μm。 请点击这里下载此文件。
补充图2:有丝分裂后移植2个月PT的hdINs到新生WT小鼠的海马体中。 在(A)幼稚和(B)细胞移植WT小鼠中针对增殖标记Ki67和细胞质人标记STEM121的免疫荧光。(b) STEM121阳性细胞的放大图像。黄色箭头表示 Ki67 呈阳性的细胞和 STEM121 的阴性细胞。白色箭头表示 STEM121 阳性细胞和 Ki67 阴性细胞。白色星号表示侧心室。比例尺:100 μm。 请点击这里下载此文件。
Discussion
本协议描述了一种稳健,快速,简单且广泛可及的体 外 生成hdIN前体的方法,并将其用作神经发育障碍临床前模型中的早期介入细胞疗法。
尽管神经发育障碍的一些特征性表型出现在青春期或成年期,但在早期发育期间已经存在病理生理改变。出于这个原因,早期干预对于在症状或临床表现之前的关键大脑发育时期采取行动来实现有益效果是非常必要的。未来,基因筛查和生物标志物的开发将提供预防性或症状前治疗,为这些患者带来改变游戏规则。因此,hdIN前体在 Cntnap2 KO小鼠模型中出生后早期移植,当时神经元网络中的致痫变化可能正在进行28 ,并且在该动物模型中描述了细胞改变的时间点29。然而,重要的是要考虑年龄推断的潜在陷阱以及小鼠与人脑中某些过程的时间。
专注于程序本身,这里介绍的分化方案基于转录因子的使用,与其他地方基于小分子10,30的其他方案相比,转录因子允许快速有效地对干细胞进行编程。这种方法的一个潜在缺点可能是需要慢病毒载体,这会带来插入诱变的风险。该方案中的两个关键步骤是将抗生素和抗有丝分裂剂添加到培养基中,以选择表达转录因子的细胞并消除增殖细胞,分别避免畸胎瘤形成的风险。尽管本研究中仅测试了hdIN前体,但预计该程序对于其他细胞来源和编程/分化方案是可行的。然而,其他神经元亚型和/或模型应得到验证。
hdIN前体的移植年龄为7 DIV,是根据(i)增殖细胞的缺失决定的,通过对Ki67的免疫反应性进行评估,(ii)以及先前报道的多能性基因(如POU5F1)表达减少的观察以及该时间点8的神经元标记MAP2和中间神经元标记GAD1的出现.然而,描述该方案的原始工作在DOX戒断后14 DIV进行了移植9。这就提出了一个问题,即母亲饮用水中的DOX是否可以通过乳汁到达移植到哺乳幼崽大脑中的细胞,或者7 DIV的DOX诱导是否足以确定GABA能命运。尽管Yang等人确定14天的DOX足以在体外产生稳定的神经元细胞9,但Gonzalez-Ramos等人8已经在7 DIV检测到GAD1基因表达,表明Ascl1和Dlx2对GAD67的下游激活已经在这个时间点发生。因此,图案化从 7 DIV 开始,并且可能不太依赖于 DOX 处理。此外,啮齿动物和人类的证据表明母乳中存在DOX 31,32,这里介绍的结果表明,移植的hdINs在2周和2个月PT时对Ascl1具有免疫反应性,在9个月PT时对中间神经元标志物具有免疫反应性。在移植人群中,除了PV和SST阳性神经元外,还发现了较低数量的中间神经元亚群的其他标记物,例如钙视黄蛋白(CR)和钙结合素(CB)。
该程序的一个具有挑战性的方面是协调分化和幼崽年龄的时间。通常,小鼠在建立交配笼后需要 21 天妊娠,尽管有时会有所不同。在成年啮齿动物中进行细胞移植时,当一切都可以仔细计划和安排时,这种情况不会发生。然而,这可以通过设置两到三个间隔为2天的交配笼或两到三个间隔为2天的分化批次来轻松缓解。
尽管本研究中使用的小鼠既没有免疫缺陷也没有免疫抑制,但移植的细胞在体内存活了长达9个月,并且在P14或2个月PT时都没有观察到针对异种细胞或局部炎症的免疫反应标志物。 移植异种细胞的免疫排斥被触发针对MHC /肽,移植排斥的关键细胞介质是T淋巴细胞和小胶质细胞33,34.因此,探索了对T细胞标志物以及反应性小胶质细胞的免疫反应性。在P14或2个月时,通过反应性小胶质细胞的水平或WT小鼠中T淋巴细胞的存在,没有检测到宿主组织中移植细胞的免疫排斥迹象。此外,根据评估的星形胶质增生和炎性细胞因子的水平,未观察到局部炎症。这一结果可能部分取决于新生儿免疫耐受性35,36,37,由其他细胞身份,位置和动物模型35,38观察到。Englund等人确定了移植细胞在迁移和成熟方面的区域差异,包括观察相邻白质中的移植细胞35。
最后,与其他移植到成年啮齿动物中的研究相比,观察到海马体内移植细胞的更大分散,其中hdIN仍作为移植的核心25。这种分散也与Yang等人之前观察到的结果不同9,在这种情况下,可以通过移植时细胞的年龄来解释。
Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
该项目由瑞典研究委员会(批准号:2016-02605,MA)、瑞典脑基金会F02021-0369(MA)、克拉福德基金会(MA)和欧盟地平线2020计划(H2020-MSCA-ITN-2016)资助,在Marie Skłodowska-Curie创新培训网络项目Training4CRM No. 722779(M.K.)下。我们非常感谢Josep Maria Canals实验室(巴塞罗那大学干细胞和再生医学实验室)的Andrés Miguez的帮助,教授P2新生小鼠的立体定位细胞移植,以及德克萨斯大学奥斯汀分校的小组负责人Mackenzie Howard的建议和初步坐标。我们感谢Susanne Geres协助动物护理和Ling Cao帮助处理组织,以及以某种方式为研究做出贡献的学生,特别是Diana Hatamian。最后,用于说明本文的一些图形是用 BioRender.com 创建的。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
30 G needle | B Braun | 4656300 | |
33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
Cy3 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium - Transplantation medium |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
Microscope Software | Olympus | CellSens | |
Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement - Stem cell culture medium |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Pertex | HistoLab | 811 | |
Pipet Filler | |||
Play-Doh | |||
Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
Tweezer | VWR | ||
Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
Xylene | VWR | 28973.363 | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |
References
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