Трансплантация человеческих плюрипотентных ГАМКергических нейронов, полученных из стволовых клеток, генерируемых нейронным программированием, может быть потенциальным подходом к лечению расстройств нервного развития. Этот протокол описывает генерацию и трансплантацию ГАМКергических нейронных предшественников, полученных из стволовых клеток человека, в мозг неонатальных мышей, что позволяет проводить долгосрочное исследование привитых нейронов и оценивать их терапевтический потенциал.
Уменьшенное количество или дисфункция ингибирующих интернейронов является распространенным фактором нарушения нервного развития. Поэтому клеточная терапия с использованием интернейронов для замены или смягчения эффектов измененных нейронных цепей является привлекательным терапевтическим направлением. С этой целью необходимо больше знаний о том, как ГАМКергические интернейроноподобные клетки (hdIN), полученные из стволовых клеток человека, созревают, интегрируются и функционируют с течением времени в схеме хозяина. Особое значение при нарушениях нервного развития имеет лучшее понимание того, влияют ли на эти процессы в трансплантированных клетках развивающийся и созревающий мозг хозяина. Настоящий протокол описывает быструю и высокоэффективную генерацию hdIN из эмбриональных стволовых клеток человека на основе трансгенной экспрессии транскрипционных факторов Ascl1 и Dlx2. Эти предшественники нейронов пересаживаются в одностороннем порядке, через 7 дней in vitro, в гиппокамп неонатальных 2-дневных мышей. Трансплантированные нейроны рассеиваются в ипси- и контралатеральном гиппокампе мышиной модели кортикальной дисплазии-синдрома фокальной эпилепсии и выживают до 9 месяцев после трансплантации. Этот подход позволяет исследовать клеточную идентичность, интеграцию, функциональность и терапевтический потенциал трансплантированных интернейронов в течение длительного времени в развитии здорового и больного мозга.
Установление, созревание и уточнение нейронных сетей происходит в перинатальном и раннем постнатальном периоде и является решающим временным окном для развития мозга1. От послеродового изобилия связи мозг развивается до тонкой настройки связей, которые простираются до подросткового возраста2. Следовательно, изменения в генах, экспрессируемых в эти периоды, а также внешние факторы или инсульты определяют предрасположенность человека к множественным нарушениям развития нервной системы. Нарушения в познании и двигательной функции разворачиваются с течением времени, а фармакологическое лечение ограничено, большинство из них нацелены на симптомы с риском серьезных побочных эффектов.
Было показано, что дисфункция эргического ингибирования гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) является основным фактором, способствующим основной причине различных нарушений нервного развития3, таких как синдром хрупкой Х, синдром Ангельмана, эпилепсия, шизофрения и аутизм. ГАМК является основным ингибирующим передатчиком центральной нервной системы и играет важную роль в поддержании возбуждающего/тормозного (E/I) баланса, синхронизации возбуждения нейронов и вычислений. ГАМКергические интернейроны представляют собой гетерогенную популяцию нейронов, с возрастающей функциональной сложностью в более сложных областях мозга4 и с эволюцией 5,6. Учитывая ограниченную эндогенную регенеративную способность человеческого мозга и последствия дисфункции интернейрона в нескольких неврологических расстройствах, трансплантация ГАМКергических интернейронов может быть многообещающим терапевтическим направлением для изучения. Таким образом, полученные из стволовых клеток человека ГАМКергические интернейроноподобные клетки (hdIN), по-видимому, являются наиболее трансляционным и жизнеспособным источником для этой цели по сравнению с аллогенными предшественниками нейронов грызунов или другими источниками, используемыми в других местах7. Протоколы для генерации ГАМКергических нейронов из различных клеточных источников доступны 8,9,10,11,12,13, но требуется больше знаний о том, как hdIN созревают, интегрируются и функционируют с течением времени в развивающемся патологическом мозге. В нескольких исследованиях были выявлены изменения в генах, активных во время кортикального паттерна, установления нейронной связности14 и настройки физиологического баланса E/I15. Неонатальная трансплантация hdIN в мышиные модели с соответствующими генетическими возмущениями позволяет нам следить за взаимодействием между хозяином и трансплантатом, что является знанием, необходимым для определения потенциальных терапевтических стратегий.
Иммуномодуляция обычно и успешно используется при трансплантации ксенотрансплантата, чтобы избежать запуска иммунного ответа хозяина и отторжения16. Однако введение иммуносупрессивных препаратов, таких как циклоспорин А, вызывает почечную токсичность после хронического введения, является трудоемким из-за необходимости ежедневных внутрибрюшинных инъекций для достижения стабильных системных концентраций, вызывающих стресс у животных17, и имеет нецелевые эффекты, которые могут взаимодействовать с патологией18. Кроме того, было показано, что компрометация иммунной системы изменяет поведенческие фенотипы19 с изменениями в соответствующих нейроанатомических областях20. Было показано, что трансплантация в первую неделю жизни позволяет адаптироваться к трансплантированным клеткам21,22, в то время как другие сообщили о первоначальной выживаемости с последующим отторжением трансплантатов в течение первого постнатального месяца23,24.
Этот протокол описывает процедуры от генерации hdIN до трансплантации клеток у неонатальных мышей, приводящие к долгосрочной выживаемости трансплантата и позволяющие исследовать специфичность нейронов, синаптическую интеграцию, функцию и терапевтический потенциал трансплантированных интернейронов человека во время физиологического и патологического развития.
Настоящий протокол описывает надежную, быструю, простую и широко доступную методологию генерации предшественников hdIN in vitro и ее использование в качестве ранней интервенционной клеточной терапии в доклинических моделях нарушений нервного развития.
Несмотря на то, что некоторые из характерных фенотипов нарушений нервного развития возникают в подростковом или взрослом возрасте, патофизиологические изменения уже присутствуют в раннем развитии. По этой причине раннее вмешательство было бы очень оправдано для достижения благотворного эффекта, действуя в критические периоды развития мозга до симптоматики или клинического проявления. В будущем генетический скрининг и разработка биомаркеров позволят профилактическое или предсимптоматическое лечение, что изменит правила игры для этих пациентов. Таким образом, предшественники hdIN были пересажены в начале после рождения в мышиную модель Cntnap2 KO, когда эпилептогенные изменения в нейронной сети могут продолжаться28 и в точку времени, когда клеточные изменения были описаны в этой модели29 животных. Важно, однако, учитывать потенциальные подводные камни экстраполяции возраста и времени определенных процессов в мыши по сравнению с человеческим мозгом.
Ориентируясь на саму процедуру, представленный здесь протокол дифференцировки основан на использовании факторов транскрипции, которые позволяют быстро и высокоэффективно программировать стволовые клетки по сравнению с другими протоколами в других местах на основе малых молекул10,30. Потенциальным недостатком этого подхода может быть потребность в лентивирусных векторах, что сопряжено с риском вставочного мутагенеза. Двумя критическими шагами в протоколе являются добавление антибиотиков и антимитотического агента в среду для отбора клеток, экспрессирующих факторы транскрипции, и устранения пролиферативных клеток, избегая риска образования тератомы, соответственно. Хотя в этом исследовании были протестированы только предшественники hdIN, ожидается, что процедура будет осуществима с другими источниками клеток и протоколами программирования / дифференцировки. Тем не менее, другие нейронные подтипы и/или модели должны быть проверены.
Возраст предшественника hdIN для трансплантации, 7 DIV, был определен на основе (i) отсутствия пролиферативных клеток, оцениваемых иммунореактивностью в отношении Ki67, (ii) вместе с ранее сообщенными наблюдениями снижения экспрессии генов плюрипотентности, таких как POU5F1, и появления нейронального маркера MAP2 и интернейронного маркера GAD1 в этой точкевремени 8 . Тем не менее, оригинальная работа, описывающая этот протокол, выполняла трансплантацию при 14 DIV после отмены DOX9. Это поднимает вопросы о том, может ли DOX в питьевой воде матери достичь клеток, привитых в мозг кормящих щенков через молоко, или 7 DIV индукции DOX достаточно, чтобы установить ГАМКергическую судьбу. Хотя Янг и др. определили 14 дней DOX как достаточные для генерации стабильных нейрональных клеток in vitro9, Gonzalez-Ramos et al.8 обнаружили экспрессию гена GAD1 уже при 7 DIV, что указывает на то, что последующая активация GAD67 Ascl1 и Dlx2 уже произошла в этот момент времени. Следовательно, моделирование началось с 7 DIV и может быть менее зависимым от лечения DOX. Кроме того, данные на грызунах и людях указывают на наличие DOX вгрудном молоке 31,32, а результаты, представленные здесь, показывают, что привитые hdIN были иммунореактивными для Ascl1 через 2 недели и 2 месяца PT и интернейронные маркеры позже через 9 месяцев PT. В привитой популяции, помимо PV и SST-положительных нейронов, другие маркеры субпопуляций интернейронов также были обнаружены в более низких количествах, таких как кальретинин (CR) и кальбиндин (CB).
Сложным аспектом этой процедуры является координация сроков как для дифференциации, так и для возраста щенков. Обычно беременность мыши занимает 21 день после установки брачной клетки, хотя иногда это может варьироваться. Такой сценарий не возникает при выполнении трансплантации клеток у взрослых грызунов, когда все можно тщательно спланировать и организовать. Тем не менее, это можно легко смягчить, установив две-три клетки для спаривания с интервалом в 2 дня или две-три партии дифференциации с 2-дневным интервалом друг от друга.
Хотя мыши, использованные в этом исследовании, не были ни иммунодефицитными, ни иммуносупрессированными, трансплантированные клетки выживали до 9 месяцев in vivo, а маркеры иммунной реакции против ксеногенных клеток или местного воспаления не наблюдались ни на P14, ни на 2 месяцах PT. Иммунное отторжение трансплантированных ксеногенных клеток запускается против MHC / пептидов, а ключевыми клеточными медиаторами отторжения трансплантата являются Т-лимфоциты и микроглиальные клетки33, 34. Поэтому была исследована иммунореактивность к маркерам Т-клеток, а также реактивная микроглия. Никаких признаков иммунного отторжения трансплантированных клеток в ткани хозяина не было обнаружено ни по уровням реактивной микроглии, ни по присутствию Т-лимфоцитов у мышей WT через P14 или 2 месяца. Кроме того, не наблюдалось местного воспаления на основе оцененных уровней астроглиоза и воспалительных цитокинов. Этот исход может частично зависеть от неонатальной иммунной толерантности 35,36,37, наблюдаемой другими клеточными идентичностями, местоположениями и животными моделями 35,38. Englund et al. идентифицировали региональные различия в исходе трансплантированных клеток с точки зрения миграции и созревания, включая наблюдение за привитыми клетками в соседнем белом веществе35.
Наконец, наблюдалась большая дисперсия привитых клеток в гиппокампе по сравнению с другими исследованиями, трансплантированными взрослым грызунам, где hdIN оставались в виде привитого ядра25. Эта дисперсия также отличалась от результатов, наблюдаемых ранее Янгом и др.9, что может быть объяснено в данном случае возрастом клеток на момент трансплантации.
The authors have nothing to disclose.
Этот проект финансировался Шведским исследовательским советом (номер гранта: 2016-02605, M.A.), Шведским фондом мозга F02021-0369 (M.A.), Фондом Крафурда (M.A.) и Программой Европейского Союза Horizon 2020 (H2020-MSCA-ITN-2016) в рамках проекта Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network Training4CRM No. 722779 (M.K.). Мы чрезвычайно благодарны за помощь Андресу Мигесу из лаборатории Хосепа Марии Каналса (Лаборатория стволовых клеток и регенеративной медицины, Университет Барселоны) за обучение трансплантации стереотаксических клеток у новорожденных мышей P2 и Маккензи Ховард, руководителя группы в Техасском университете в Остине, за советы и предварительные координаты для трансплантации клеток в гиппокамп новорожденных мышей P2. Мы благодарим Сюзанну Герес за помощь в уходе за животными и Лин Цао за помощь в обработке тканей, а также студентов, которые так или иначе внесли свой вклад в исследование, и в частности Диану Хатамиан. Наконец, некоторые из графиков, используемых для иллюстрации этой статьи, были созданы с BioRender.com.
30 G needle | B Braun | 4656300 | |
33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
Cy3 Stretavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium – Transplantation medium |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
Microscope Software | Olympus | CellSens | |
Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement – Stem cell culture medium |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Pertex | HistoLab | 811 | |
Pipet Filler | |||
Play-Doh | |||
Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
Tweezer | VWR | ||
Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
Xylene | VWR | 28973.363 | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |