Summary
यहां प्रस्तुत इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड सेल पेलेट नियंत्रण उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल है।
Abstract
लक्ष्य प्रोटीन की ज्ञात अभिव्यक्ति के साथ सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) परख के विकास के लिए आवश्यक हैं। जबकि ऊतक नियंत्रण परिभाषित ऊतक और सेलुलर अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ अच्छी तरह से विशेषता वाले प्रोटीन के लिए फायदेमंद होते हैं, वे नए, खराब विशेषता वाले या सर्वव्यापी रूप से व्यक्त प्रोटीन के लिए आईएचसी परख के प्रारंभिक विकास के लिए कम उपयुक्त होते हैं। वैकल्पिक रूप से, उनकी मानकीकृत प्रकृति के कारण, सेल छर्रों, जिसमें परिभाषित प्रोटीन या प्रतिलेख अभिव्यक्ति स्तर (जैसे, उच्च, मध्यम और निम्न अभिव्यक्ति) के साथ कैंसर सेल लाइनें शामिल हैं, ट्रांसक्रिप्टेड ओवर-एक्सप्रेसिंग सेल लाइनें, या सीआरआईएसपीआर जैसी सेल इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों के माध्यम से हटाए गए जीन के साथ सेल लाइनें, मूल्यवान नियंत्रण के रूप में काम कर सकती हैं, खासकर प्रारंभिक एंटीबॉडी लक्षण वर्णन और चयन के लिए। फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों के लिए आईएचसी परख के विकास में इन सेल छर्रों का उपयोग करने के लिए, उन्हें इस तरह से संसाधित और एम्बेडेड करने की आवश्यकता होती है जो ऊतक प्रसंस्करण के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं को पुन: व्यवस्थित करता है। यह प्रोटोकॉल फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड सेल पेलेट नियंत्रण बनाने और संसाधित करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है जिसका उपयोग आईएचसी विधि विकास के लिए किया जा सकता है।
Introduction
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) खोजी और नैदानिक विकृति में सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले परखों में से एक है। संदर्भ और परख के आधार पर, आईएचसी का उपयोग कैंसर निदान 1,2 में सहायता के लिए किया जाता है, उपचार प्रतिक्रिया 3,4 की भविष्यवाणी करता है, रोगजनकों5 की पहचान करता है, रोगग्रस्त ऊतकों में सेलप्रकारों को चिह्नित करता है 6, और जैविक मार्गों और ऊतक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करता है 7,8। सभी स्थितियों में, एक आईएचसी परख का मूल सिद्धांत यह है कि एक एंटीबॉडी विशेष रूप से रुचि के लक्ष्य को बांधता है, आमतौर पर एक प्रोटीन, और इस बाध्यकारी घटना को बाद में एक ऊतक खंड9 में देखा जाता है। हालांकि, किसी भी आईएचसी परख की सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक यह आश्वासन दे रहा है कि एंटीबॉडी विशेष रूप से ब्याज10 के लक्ष्य का पता लगा रहे हैं। एंटीबॉडी विशिष्टता अधिकांश इम्यूनोएसे में एक चुनौती है, लेकिन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अद्वितीय चुनौतियां प्रदान करता है कि विशिष्ट और निरर्थक लेबलिंग के बीच अंतर करने के लिए आणविक भार जैसे कोई द्वितीयक उपाय नहीं हैं। यह विशेष रूप से परेशानी भरा है जब खराब विशेषता या सर्वव्यापी रूप से व्यक्त लक्ष्यों का मूल्यांकन किया जाता है जिनमें अच्छी तरह से परिभाषित सेलुलर स्थानीयकरण पैटर्न की कमी होती है। इसलिए, मजबूत नियंत्रण जो बाध्यकारी विशिष्टता को चिह्नित करने में मदद कर सकते हैं, एक नया आईएचसी परख10 विकसित करते समय महत्वपूर्ण हैं।
उन लक्ष्यों के लिए जो विशिष्ट सेलुलर अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ अच्छी तरह से परिभाषित हैं, ऊतक नियंत्रण अक्सर आईएचसी विधि विकास में उपयोग किए जाते हैं। पूर्व डेटा के धन के आधार पर, कोई यह निर्धारित कर सकता है कि एंटीबॉडी ऊतक, कोशिका और उपकोशिकीय डिब्बे को लेबल कर रहा है जिसमें इसे व्यक्त किया जाना चाहिए, और यह ऊतक घटकों को लेबल नहीं कर रहा है जहांयह मौजूद नहीं होना चाहिए। हालांकि, ऊतक नियंत्रण खराब विशेषता वाले, ज्ञात अभिव्यक्ति पैटर्न के बिना नए लक्ष्यों के लिए सीमित उपयोग के होते हैं या प्रोटीन के लिए जो व्यापक रूप से व्यक्त किए जाते हैं और अलग-अलग अभिव्यक्ति पैटर्न की कमी होती है। इन दोनों परिदृश्यों में, एक अच्छी तरह से परिभाषित अभिव्यक्ति पैटर्न की कमी ऊतकों में गैर-विशिष्ट लेबलिंग से विशिष्ट भेदभाव करना असंभव बनाती है। इन स्थितियों में, सेल छर्रों एक मूल्यवान वैकल्पिक आईएचसी नियंत्रण प्रदान करते हैं। सेल पेलेट नियंत्रण में शामिल हो सकते हैं: कैंसर या अन्य सेल लाइनें जिनमें रुचि के प्रोटीन के अंतर्जात या आंतरिक / गैर-प्रेरित अभिव्यक्ति स्तर होते हैं, और जिनकी प्रोटीन अभिव्यक्ति को पश्चिमी सोख्ता, प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण, या ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग से विस्तारित किया जा सकता है; इंजीनियर सेल लाइनें जो या तो रुचि के प्रोटीन को अधिक व्यक्त करती हैं या रुचि के एन्कोडिंग जीन को हटा दिया जाता है; या कोशिकाएं जिन्हें प्रोटीन अभिव्यक्ति या रुचि की संकेत घटनाओं (जैसे, फॉस्फोराइलेशन) को प्रेरित करने के लिए विशिष्ट परिस्थितियों में इलाज किया गया है। सेल लाइनों में अच्छी तरह से विशेषता वाले प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर भी उच्च, मध्यम, निम्न और अनुपस्थित प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ सेल लाइनों के पैनल का उपयोग करके परख की संवेदनशीलता के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, इंजीनियर सेल छर्रों पशु चिकित्सा प्रजातियों के लिए मूल्यवान प्रजाति विशिष्ट नियंत्रण हो सकते हैं, जिसके लिए सीमित लक्षण वर्णन या उपलब्ध ऊतक नियंत्रण हो सकतेहैं। जबकि सेल छर्रों की अपनी सीमाएं हैं, जैसे कि सेल लाइनों में मौजूद सीमित प्रोटिओम जो ऊतकों में विविध प्रोटिओम को प्रतिबिंबित नहीं करेगा, वे यह पुष्टि करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण के रूप में काम करते हैं कि एंटीबॉडी रुचि के लक्ष्य का पता लगा सकता है और साथ ही परख10 में प्राथमिक एंटीबॉडी, द्वितीयक एंटीबॉडी या अन्य रीजेंट द्वारा अंधाधुंध बंधन से इनकार कर सकता है।
नैदानिक और जांच विकृति में अधिकांश ऊतक तटस्थ बफर्ड फॉर्मेलिन में तय किए जाते हैं, अल्कोहल की एक श्रृंखला में निर्जलित होते हैं, जाइलीन में साफ होते हैं, और पैराफिन मोम में संसाधित और एम्बेडेड होते हैं। फॉर्मेलिन निर्धारण क्रॉस-लिंक प्रोटीन, और निर्धारण और ऊतक प्रसंस्करण में प्रत्येक अतिरिक्त चरण सीधे प्रोटीन और एंटीबॉडी की क्षमता को प्रभावित कर सकता हैताकि उनका पता लगाया जा सके। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि आईएचसी परख में उपयोग किए जाने वाले किसी भी नियंत्रण को एक ही निर्धारण, ऊतक प्रसंस्करण और एम्बेडिंग प्रक्रियाओं से गुजरना पड़ता है। यह लेख फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड ऊतकों में आईएचसी परख विकसित करने के लिए नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं को संसाधित करने और एम्बेड करने के लिए अद्वितीय विचारों का वर्णन करता है, जिसमें कार्यप्रणाली मुख्य रूप से हिस्टोलॉजी प्रयोगशाला में सेल गोली की हैंडलिंग और प्रसंस्करण पर ध्यान केंद्रित करती है।
Protocol
1. सेल गोली तैयारी
- चार से आठ 150 मिमी2 या आठ x T175 फ्लास्क में, कोशिका लाइन के लिए अनुशंसित माध्यम और स्थितियों में कोशिकाओं को 80% -90% संगम तक बढ़ाएं। उदाहरण के लिए, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन15 के साथ डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम) में 293 टी कोशिकाओं को विकसित करें।
नोट: सेल लाइन ऑफ इंटरेस्ट 16 के लिए आवश्यक शर्तों और माध्यम का उपयोग करके कोशिकाओं कोउगाया जाना चाहिए। ये स्थितियां सेल लाइन के आधार पर भिन्न हो सकती हैं, लेकिन डाउनस्ट्रीम पेलेटिंग विधियों को संस्कृति स्थितियों से स्वतंत्र सेल लाइनों के लिए अनुकूलनीय होना चाहिए। - एक बार जब कोशिकाएं संगम (80% -90%) के पास होती हैं, तो विकास मीडिया को वैक्यूम पिपेट के साथ एस्पिरेट करें और फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में कोशिकाओं को कुल्ला करें।
- प्रत्येक फ्लास्क में 5-10 mM EDTA का 5 mL जोड़ें और फ्लास्क को 5-10 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को हटाने के लिए फ्लास्क के किनारे को धीरे से टैप करें।
नोट: ट्रिप्सिन का उपयोग न करें क्योंकि यह सतह एपिटोप्स को छोड़ सकता है जो कुछ एंटीजन पर प्रतिकूल प्रभाव डालेगा।- एक बार जब कोशिकाओं को हटा दिया जाता है, तो प्रत्येक फ्लास्क में सेल लाइन (जैसे, 293 टी कोशिकाओं के लिए डीएमईएम) के लिए उपयोग किए जाने वाले 5 एमएल विकास मीडिया जोड़ें, फिर कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
- शंक्वाकार ट्यूबों को 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 930 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, वैक्यूम पिपेट आकांक्षा द्वारा मीडिया और ईडीटीए को हटा दें।
- सेल छर्रों को 1x PBS के 10-20 mL में धोएं और, यदि कई प्लेटों या फ्लास्क का उपयोग किया जाता है, तो प्लेटों या फ्लास्क (चित्रा 1 में दर्शाए गए प्रयोग में लगभग छह T175 फ्लास्क) से कोशिकाओं को एकल 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूल करें।
- ट्यूब को 5 मिनट के लिए 930 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। वैक्यूम पिपेट के साथ सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पीबीएस को एस्पाइरेट करें।
- सेल पेलेट ट्यूब को स्थिर होने तक गीली बर्फ पर रखें।
नोट: कोशिकाओं को डिग्रेडेटिव एंजाइम गतिविधि को सीमित करने और प्रोटीन स्थानीयकरण में परिवर्तन सहित कोशिकाओं के ऑटोलिसिस और संबंधित प्रोटीन परिवर्तनों को कम करने के लिए ठंडा रखा जाता है।
2. सेल पेलेट का निर्धारण
- सेल अनुपात के लिए 10: 1 (वॉल्यूम: वॉल्यूम) फिक्सेटिव बनाने के लिए 3 एमएल सेल पेलेट में 10% न्यूट्रल बफर्ड फॉर्मेलिन के 30 एमएल जोड़कर निर्धारण करें।
- कसकर ढकी हुई 50 एमएल ट्यूब को बार-बार उलटें जब तक कि कोशिकाएं पूरी तरह से निलंबन में न हों।
नोट: पूर्ण निर्धारण से पहले एक संघनित सेल गोली का गठन असमान निर्धारण का कारण बन सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बाद में धुंधला और इम्यूनोलेबलिंग प्रक्रियाओं के दौरान कलाकृतियां होती हैं। - सेल निलंबन को कमरे के तापमान पर रात भर व्यवस्थित होने दें।
- कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए अगले दिन ट्यूब को फिर से मोड़ें, निर्धारण में सुधार के लिए सतह से मात्रा अनुपात में वृद्धि करें।
नोट: सेल गोली को भंवर करने की आवश्यकता या सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि इसके परिणामस्वरूप सेल क्षति हो सकती है।
3. सेल पेलेट की ट्रिमिंग और प्रसंस्करण
- 24 घंटे के निर्धारण के बाद, 10-15 मिनट के लिए 5 डिग्री सेल्सियस पर 930 x g पर 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सुनिश्चित करें कि ट्यूबों को कसकर कवर किया गया है, समान रूप से वितरित किया गया है, और सेंट्रीफ्यूज में संतुलित किया गया है।
नोट: प्रयोगशाला द्वारा उपयोग किए जाने वाले ऊतक निर्धारण समय या विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों की आवश्यकताओं को प्रतिबिंबित करने के लिए निर्धारण समय को संशोधित किया जा सकता है। - सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं एक दृश्यमान गोली बनाती हैं। बाँझ स्थानांतरण पिपेट के साथ डिकैंटिंग और / या सावधानीपूर्वक एस्पिरेटिंग करके फिक्सेटिव को हटा दें।
- सेल पेलेट अनुपात में 1: 4 (वॉल्यूम: वॉल्यूम) जेल पर सेल गोली में पिघला हुआ (40-60 डिग्री सेल्सियस) हाइड्रोक्सीइथाइल एगारोस-आधारित जेल ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
- नल के पानी से धोए गए आंख के साथ एक साफ 5 इंच, 2 मिमी टिप स्टर्लिंग जांच का उपयोग करके, पिघले हुए जेल को धीरे से निश्चित सेल गोली में हिलाएं, जिससे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब (चित्रा 1 ए) के तल पर पिघले हुए जेल में निश्चित कोशिकाओं का एक समान निलंबन बन जाता है।
- जेल्ड सेल पेलेट को ठोस करने के लिए गीली बर्फ पर फिक्स्ड सेल पेलेट के साथ मिश्रित पिघले हुए जेल के साथ कैप्ड 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को 5-10 मिनट के लिए रखें।
- एक साफ माइक्रो-स्पैटुला का उपयोग करके, ट्यूब के किनारे एक स्पैटुला रखकर शंक्वाकार ट्यूब से गोली को सावधानीपूर्वक हटा दें और धीरे से इसे छेदे बिना गोली का लाभ उठाएं। गोली को बायोप्सी पेपर पर रखें।
- एक साफ माइक्रो-स्पैटुला का उपयोग करके, सेल पेलेट को 4-5 मिमी मोटी स्लाइस में ट्रिम करें, ताकि प्रत्येक टुकड़ा 26 मिमी x 26 मिमी x 5 मिमी ऊतक कैसेट (चित्रा 1 बी) में फिट हो सके।
- बायोप्सी पेपर के एक टुकड़े के केंद्र में अलग-अलग जेल गोली स्लाइस रखें। पेलेट के ऊपर बायोप्सी पेपर के दो विरोधी सिरों को मोड़ें, इसे लपेटें। लपेटी हुई गोली को 26 मिमी x 26 मिमी x 5 मिमी ऊतक कैसेट में रखें। ऊतक कैसेट ढक्कन (चित्रा 1 सी) के साथ बायोप्सी लपेटने के अनफोल्डेड किनारों को दबाते हुए ढक्कन बंद करें।
- छंटनी किए गए सेल पेलेट कैसेट को ऊतक प्रोसेसर में रखें जो 10% तटस्थ बफर्ड फॉर्मेलिन से भरा है और एक छोटे प्रसंस्करण कार्यक्रम पर चलाता है।
नोट: लघु प्रसंस्करण अनुसूची में 10% तटस्थ बफर्ड फॉर्मेलिन से शुरू होने वाले प्रत्येक रिटॉर्ट में 30 मिनट होते हैं, जो तेजी से वर्गीकृत अल्कोहल की एक श्रृंखला के माध्यम से निर्जलित होते हैं, जाइलीन के तीन परिवर्तनों में साफ होते हैं, और 60 डिग्री सेल्सियस पिघले हुए घुसपैठ / पैराफिन (56 डिग्री सेल्सियस पिघलने बिंदु) के दो परिवर्तनों में पैराफिन घुसपैठ के साथ समाप्त होते हैं।
4. सेल पेलेट का एम्बेडिंग
- संसाधित कैसेट को एम्बेडिंग केंद्र के होल्डिंग क्षेत्र में रखें।
- ऊतक कैसेट ढक्कन खोलें और बायोप्सी पेपर को सावधानीपूर्वक खोलें।
- सेल पेलेट को एक छोटे 15 मिमी x 15 मिमी डिस्पोजेबल एम्बेडिंग मोल्ड में रखें, कट-साइड नीचे।
नोट: एक छोटा एम्बेडिंग मोल्ड आईएचसी परख के लिए एक बिना दाग वाले ऊतक स्लाइड पर फिट होने के लिए तीन सेल पेलेट वर्गों की अनुमति देता है। - धीरे से मोल्ड के तल में सेल पेलेट को बल के साथ पकड़ते हुए, सेल गोली को कवर करते हुए मोल्ड में 62 डिग्री सेल्सियस ऊतक घुसपैठ / पैराफिन एम्बेड करें।
- पैराफिन को ठोस बनाने के लिए मोल्ड को ठंडे ब्लॉक में ले जाएं। सेल छर्रों को समायोजित करें जबकि पैराफिन मोल्ड के तल पर उनकी उपयुक्त स्थिति में उन्हें ठीक करने के लिए ठोस हो रहा है।
- कैसेट से ढक्कन हटा दें। एम्बेडिंग मोल्ड के शीर्ष पर कैसेट को नीचे की ओर रखें और कैसेट को कवर करने के लिए अतिरिक्त पिघला हुआ पैराफिन जोड़ें।
- जब पैराफिन ऊतक कैसेट पर भर जाता है, तो17,18 को ठोस बनाने के लिए मोल्ड को ठंडे ब्लॉक में वापस कर दें।
5. सेल पेलेट का सेक्शनिंग
- सेल पेलेट ब्लॉक को ट्रिम करने के लिए 20 μm की सेक्शनिंग मोटाई पर एक रोटरी माइक्रोटोम सेट का उपयोग करें जब तक कि पैराफिन ब्लॉक का पूरा चेहरा और सेल गोली पैराफिन सेक्शन रिबन में कैप्चर न हो जाए। इसे ब्लॉक का "सामना" कहा जाता है।
- फेस पेलेट ब्लॉक को ठंडा करें और बर्फ स्नान ट्रे पर 5-15 मिनट के लिए भिगोदें ताकि ब्लॉक को ठंडा किया जा सके और सेक्शन करने से पहले हाइड्रेट किया जा सके।
नोट: जब ब्लॉक हाइड्रेटेड होता है, तो सेल पेलेट पैराफिन रिबन में पारभासी होगी। यदि अपारदर्शी है, तो अधिक भिगोने की आवश्यकता है, और कलाकृतियां मौजूद हो सकती हैं। - सेल पेलेट ब्लॉक के पैराफिन रिबन को रोटरी माइक्रोटोम का उपयोग करके निरंतर कट मोड में 4 μm या अन्य वांछित मोटाई की मोटाई पर अनुभाग करें।
- पैराफिन रिबन को 42 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के फ्लोटेशन बाथ पर रखें।
- फ्लोटेशन बाथ से रोटरी माइक्रोटोम का उपयोग करके तैयार पैराफिन अनुभागों को सकारात्मक रूप से चार्ज स्लाइड पर उठाएं।
- कवरस्लिप और धुंधला सीमा के भीतर स्लाइड के शीर्ष पर पहला खंड रखें, दूसरे को इसके नीचे रखें और तीसरे सेल पेलेट अनुभाग को उसके नीचे रखें (चित्रा 1 डी)।
- सेक्शनिंग के बाद, स्लाइड्स को 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान (लगभग 23 डिग्री सेल्सियस) पर सुखाएं, इसके बाद 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस।
नोट: 60 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड्स को बेक करने के बाद, सेल पेलेट सेक्शन का उपयोग किसी भी मानक आईएचसी प्रोटोकॉल के साथ किया जा सकताहै, जिसमें गर्मी-प्रेरित और एंजाइम-आधारित एंटीजन पुनर्प्राप्ति का उपयोग करके प्रोटोकॉल शामिल हैं।
Representative Results
अगारोस-आधारित जेल के अलावा, सेल पेलेट को हैंडलिंग के लिए उत्तरदायी एक ठोस जिलेटिनस द्रव्यमान बनाना चाहिए (चित्रा 1 बी)। एक बार एम्बेडेड होने के बाद, गोली में एक ठोस ऊतक के समान स्थिरता होगी, और माइक्रोटोम पर नियमित रूप से अनुभाग करना अपेक्षाकृत आसान होना चाहिए। एक बार सेल छर्रों को एम्बेडेड करने के बाद, उनका उपयोग हिस्टोलॉजी और आईएचसी प्रयोगों में फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों के समान तरीके से किया जा सकता है। इसमें वाणिज्यिक आईएचसी प्लेटफार्मों9 का उपयोग करके अप्रत्यक्ष क्रोमोजेनिक पहचान विधियों (उदाहरण के लिए, हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज और डायमिनोबेंजिडीन डिटेक्शन के साथ द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करना) के साथ गर्मी-प्रेरित एपिटोप या एंजाइमेटिक एंटीजन पुनर्प्राप्ति का उपयोग शामिल है जैसा कि चित्रा 2 और चित्रा 3 में दिखाया गया है। हिस्टोलॉजिकल रूप से, कोशिकाओं को न्यूनतम सेल क्लंपिंग के साथ पूरे खंड में समान रूप से फैलाया जाना चाहिए, हालांकि अनुयायी कोशिकाएं गोली में अपने सेल-सेल इंटरैक्शन को बनाए रख सकती हैं। यह फैलाव व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच अंतर की अनुमति देता है, हालांकि यह भेद जेल गोली के भीतर सेल आकार और सापेक्ष घनत्व से काफी प्रभावित होगा। नाभिक, साइटोप्लाज्म और कोशिका झिल्ली फैलाव पर अधिक विशिष्ट और कल्पना करना आसान है (चित्रा 2)। चित्रा 2 में, टीईएडी प्रतिलेखन कारक के लिए तीन सेल लाइनों को इम्युनोलेबल किया गया है। इम्यूनोलेबलिंग को भूरे रंग के डायमिनोबेंजिडाइन (डीएबी) क्रोमोजेन के साथ देखा जाता है। सेल लाइनों में टीईएडी प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति के अलग-अलग स्तर होते हैं, जो कोई अभिव्यक्ति (चित्रा 2 ए) से कमजोर अभिव्यक्ति (चित्रा 2 बी), मजबूत अभिव्यक्ति (चित्रा 2 सी) तक होते हैं। इस उदाहरण में, नाभिक में लेबलिंग देखी जाती है, जैसा कि प्रतिलेखन कारक से अपेक्षित होगा, और साइटोप्लाज्म और कोशिका झिल्ली से अनुपस्थित है, जो दिखाई देते हैं लेकिन लेबलिंग की कमी है (चित्रा 2)। सेल छर्रों को मानक 23 मिमी x 75 मिमी x 1 मिमी स्लाइड पर सेल पेलेट माइक्रोएरे (चित्रा 3) में शामिल किया जा सकता है। एक माइक्रोएरे में सेल छर्रों को शामिल करने से एक ही स्लाइड में अलग-अलग अभिव्यक्ति स्तरों के साथ नियंत्रण के मूल्यांकन की अनुमति मिलती है। इस उदाहरण में, पीईजी 10 की कमी वाले माउस भ्रूण स्टेम सेल (बाएं) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं और 293 टी कोशिकाएं जो पीईजी 10 (दाएं, ब्राउन इम्यूनोलेबलिंग) को ओवर-एक्सप्रेस करती हैं, माइक्रोएरे में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करती हैं (चित्रा 3)। सेल छर्रों के लिए ऊतक और एम्बेडिंग प्रक्रियाओं में कोई भिन्नता नहीं है जिसे माइक्रोएरे में शामिल किया जाएगा, और माइक्रोएरे को ऊतकों के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों के समान तरीकों का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकताहै।
चित्र 1: सेल पेलेट प्रोसेसिंग। (A) कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में छर्रों से निकाला जाता है और जेल के साथ मिलाया जाता है। (बी) एक बार ठोस होने के बाद, छर्रों को 26 मिमी x 26 मिमी x 5 मिमी ऊतक कैसेट में फिट करने के लिए क्रमिक रूप से काटा जाता है। (सी) ऊतक प्रोसेसर में रखे जाने से पहले सेल छर्रों को बायोप्सी पेपर में लपेटा जाता है। (डी) तीन सेल छर्रों को एकल 25 मिमी x 75 मिमी ग्लास हिस्टोलॉजी स्लाइड पर क्रमिक रूप से एकत्र किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: प्रोटीन या प्रतिलेख अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तरों के साथ सेल छर्रों का उपयोग परख की गतिशील सीमा का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। सेल छर्रों को टीईएडी प्रतिलेखन कारक के लिए इम्युनोलेबल किया जाता है और टीईएडी अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तरों का प्रदर्शन करता है। (ए) डीएयूडीआई कोशिकाओं में टीईएडी अभिव्यक्ति की कमी होती है और साइटोप्लाज्म या नाभिक में कोई इम्युनोलेबलिंग नहीं होती है। नीला दाग नाभिक का हेमेटॉक्सिलिन काउंटरस्टेन है। (बी) 293 टी कोशिकाएं टीईएडी प्रतिलेखन कारक के कमजोर परमाणु लेबलिंग (ब्राउन डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी) क्रोमोजेन) का प्रदर्शन करती हैं। (सी) डेट्रायट 562 कोशिकाएं दृढ़ता से टीईएडी को व्यक्त करती हैं जैसा कि नाभिक में तीव्र भूरे रंग के लेबलिंग द्वारा प्रदर्शित किया गया है। नाभिक के भीतर लेबलिंग, लेकिन साइटोप्लाज्म (भूरे रंग के नाभिक के चारों ओर ऑफ-व्हाइट से ग्रे क्षेत्र) नहीं, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री परख के उचित लेबलिंग को प्रदर्शित करता है। ध्यान दें कि सभी तीन सेल लाइनों में, कोशिकाओं को फैलाया जाता है, जिससे उनके परमाणु और साइटोप्लाज्मिक आकृति विज्ञान सहित व्यक्तिगत कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिलती है। स्केल बार = 25 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: अलग-अलग प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तरों के साथ कई सेल छर्रों का उपयोग करके बनाए गए सेल पेलेट माइक्रोएरे एक ही स्लाइड में नियंत्रण के एक साथ मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। पीईजी 10 की कमी वाले माउस भ्रूण स्टेम सेल (बाएं) और 293 टी कोशिकाएं पीईजी 10 (दाएं) को पीईजी 10 के लिए इम्यूनोलेबल किया जाता है। जबकि पीईजी 10 को अधिक व्यक्त करने वाली 293 टी कोशिकाओं में मजबूत लेबलिंग (ब्राउन डीएबी क्रोमोजेन) देखी जाती है, पीईजी 10 की कमी वाली कोशिकाओं में कोई लेबलिंग स्पष्ट नहीं होती है। नीला हेमेटॉक्सिलिन काउंटरस्टेन का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
यह प्रोटोकॉल फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड सेल छर्रों को उत्पन्न करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है जिसे डाउनस्ट्रीम इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और सीटू संकरण अध्ययनों के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित हिस्टोलॉजी पद्धतियां कैंसर और प्राथमिक सेल लाइनों की एक विविध श्रृंखला पर लागू होती हैं, और मुख्य रूप से इन छर्रों17,18 का उत्पादन करने के लिए नियमित हिस्टोलॉजी तकनीकों को अनुकूलित करती हैं। जब संसाधित और एम्बेडेड किया जाता है, तो छर्रों का उपयोग ऊतकों के समान तरीके से किया जा सकता है। इसमें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रयोगों के लिए गर्मी-प्रेरित और एंजाइमेटिक एंटीजन पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल के साथ उनका उपयोग करना शामिल है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली पद्धतियों का एक उद्देश्य पूरी प्रक्रिया में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान और एंटीजेनिसिटी को संरक्षित करना है। इसलिए, ईडीटीए, जो आकृति विज्ञान और एंटीजेनिसिटी दोनों में परिवर्तन के संदर्भ में अपेक्षाकृत सौम्य है, का उपयोग कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है। यह कहना नहीं है कि अन्य दृष्टिकोण, जैसे कि शारीरिक व्यवधान, व्यवहार्य नहीं हैं; हालांकि, कोशिकाओं को अलग करने के किसी भी दृष्टिकोण को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि कोशिकाएं प्रक्रिया में घायल न हों। इस प्रोटोकॉल का दूसरा उद्देश्य कोशिकाओं को ऊतकों के समान तरीके से ठीक करना और संसाधित करना है, एक ही फिक्सेटिव, फिक्सेटिव अनुपात, प्रसंस्करण अनुसूची (निर्धारण, निर्जलीकरण, समाशोधन और पैराफिन घुसपैठ) का उपयोग करना, और तकनीकों को एम्बेड करना, ताकि वे डाउनस्ट्रीम परख के लिए तुलनीय नियंत्रण के रूप में काम कर सकें। इसलिए, सेल छर्रों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले निर्धारण और प्रसंस्करण दृष्टिकोण को ऊतकों के लिए उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोणों की नकल करनी चाहिए।
इस रिपोर्ट में वर्णित प्रोटोकॉल संक्रामक एजेंटों के साथ कोशिकाओं को संभालने के लिए अनुकूलित नहीं है, जैसे कि रोगजनक बैक्टीरिया या वायरस से संक्रमित कोशिकाएं, क्योंकि कोशिकाओं को निर्धारण से पहले अलग, एकत्र और सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। जांचकर्ता अलगाव से पहले कोशिकाओं को ठीक करने के लिए प्रोटोकॉल पर विचार कर सकते हैं, लेकिन इसके लिए सेल आकृति विज्ञान को परेशान किए बिना कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए और अनुकूलन की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, संक्रामक एजेंटों के साथ कोशिकाओं के लिए निर्धारण समय और हैंडलिंग स्थितियों को संक्रामक एजेंट और संबंधित संस्थागत जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल के आधार पर अतिरिक्त विचारों की आवश्यकता होती है।
फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड सेल छर्रों को अच्छी तरह से परिभाषित प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर10 होने में विशिष्ट रूप से फायदेमंद हैं। जबकि कैंसर और अंतर्जात सेल लाइनें प्रोटीन अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तरों के साथ कोशिकाओं का चयन प्रदान करती हैं, आनुवंशिक इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियां वैज्ञानिकों को प्रोटीन अभिव्यक्ति को मॉडल करने में सक्षम बनाती हैं, रुचि के प्रोटीन को अधिक व्यक्त करने और सीआरआईएसपीआर प्रौद्योगिकियों के उपयोग के माध्यम से रुचि के एन्कोडिंग जीन20,21 . सेल लाइनों में अति-व्यक्त प्रोटीन का नुकसान यह है कि वे एक परख की संवेदनशीलता के लिए खराब उपाय हैं क्योंकि वे अंतर्जात प्रोटीन स्तर22 का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं। इसके विपरीत, अंतर्जात सेल लाइनें और कैंसर सेल लाइनें दोनों अंतर्जात अभिव्यक्ति स्तरों का बेहतर प्रतिनिधित्व कर सकती हैं, और एक आत्मीय रेखा में एन्कोडिंग जीन का सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता विलोपन संबंधित नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकता है। इसके अलावा, प्रोटीन अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तरों के साथ अंतर्जात सेल लाइनें या कैंसर सेल लाइनें अंतिम एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को चुनने और परख की संवेदनशीलता को सर्वोत्तम रूप से समझने के लिए अनुमापन प्रयोगों के लिए आदर्श हैं (चित्रा 2)। सेल लाइनों का उपयोग करने का निर्णय व्यक्तिगत प्रयोगात्मक आवश्यकताओं पर आधारित होना चाहिए और अक्सर दृष्टिकोणों के संयोजन का उपयोग करेगा।
यह मूल्यांकन करने के अलावा कि क्या एक एंटीबॉडी रुचि के प्रोटीन का पता लगा सकता है, एंटीबॉडी की विशिष्टता को परिभाषित करने के लिए सेल लाइनों के एक पैनल का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सेल लाइनों का एक पैनल जो व्यक्तिगत रूप से निकटता से संबंधित प्रोटीन के परिवार को व्यक्त करता है, का उपयोग यह परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है कि क्या एंटीबॉडी एक व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए विशिष्ट है या क्या यह अन्य निकटता से संबंधित प्रोटीन का भी पता लगाता है। अधिक विस्तृत नियंत्रणों में सेल लाइनों का उपयोग करना शामिल हो सकता है जो या तो सीआरआईएसपीआर नॉक-इन के माध्यम से या अति-अभिव्यक्ति के माध्यम से, बिंदु उत्परिवर्तन वाले प्रोटीन व्यक्त करते हैं जो विशिष्ट सिग्नलिंग घटनाओं से नहीं गुजर सकते हैं जिनका पता लगाया जा रहा है (उदाहरण के लिए, फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी का मूल्यांकन करते समय विशिष्ट फॉस्फोराइलेशन साइटों में उत्परिवर्तन)। हालांकि ये अधिक जटिल दृष्टिकोण हैं, वे यह पुष्टि करने के लिए आवश्यक हो सकते हैं कि एंटीबॉडी ने विशिष्ट परिस्थितियों में केवल लेबल का उपयोग किया।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सेल लाइनों के आनुवंशिक जोड़तोड़ एक समरूप सेल आबादी उत्पन्न नहीं कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, सेल लाइनों को अतिरंजित करने में अभिकर्मक दक्षता आमतौर पर 100% नहीं होती है और कुछ कोशिकाएं रुचि के प्रोटीन को अधिक व्यक्त नहीं कर सकती हैं। अभिकर्मक में फ्लैग या संबंधित टैग को शामिल करना जिसे मानक विधियों के साथ पता लगाया जा सकता है, सेल लाइन23 की अभिकर्मक दक्षता का आकलन करने में सहायक हो सकता है। यह निर्धारित करने के लिए सहायक हो सकता है कि अभिकर्मक सफल रहा था और प्रोटीन अभिव्यक्ति के कारण पहचान की कमी को खारिज करता है, और कोशिकाओं के अपेक्षित अनुपात के लिए एक संदर्भ के रूप में काम करता है जो रुचि के प्रोटीन को व्यक्त करना चाहिए।
सीटू संकरण (आईएसएच) सेल छर्रों में लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति को चिह्नित करने और आईएचसी विधि विकास को सूचित करने के लिए एक लाभकारी उपकरण भी होसकता है। एंटीबॉडी की स्क्रीनिंग करते समय, यह जानना जानकारीपूर्ण हो सकता है कि प्रतिलेख, और इस प्रकार संभावित प्रोटीन का पता कब लगाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, सेल पेलेट आईएसएच स्क्रीनिंग आईएसएच विधि के विकास के लिए फायदेमंद हो सकती है। जबकि विशिष्टता कम बार आईएसएच परख के लिए एक मुद्दा है, फिर भी आईएसएच अध्ययनों पर लागू किए जा सकने वाले नियंत्रणों के विकास और उपयोग के लिए उचित नियंत्रण और समान विचार होना महत्वपूर्ण है।
ऊतक माइक्रोएरे दाता ब्लॉकों से कोर को हटाकर और इन कोर को स्थानांतरित करके बनाए जाते हैं, अक्सर एक ग्रिड पैटर्न में, प्राप्तकर्ता पैराफिन ब्लॉक में। अंत में, प्राप्तकर्ता ब्लॉक में एक ही ब्लॉक में नमूनों का एक स्पेक्ट्रम होता है, जिससे ब्लॉक में सभी नमूने समान आईएचसी प्रक्रियाओं से गुजर सकते हैं और एक ही स्लाइड24,25 पर कई नमूनों की सीधी तुलना की अनुमति देते हैं। चूंकि सेल छर्रों अपेक्षाकृत समान आबादी हैं, इसलिए उन्हें 1 मिमी कोर द्वारा सटीक रूप से दर्शाया जा सकता है, जिससे उन्हें समान सरणियों में शामिल करने के लिए आदर्श उम्मीदवार बनाया जा सकता है। सेल पेलेट सरणी का उपयोग करके, अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तरों के साथ सेल छर्रों को शामिल करना संभव है, सेल छर्रों को जो विशिष्ट रूप से संबंधित प्रोटीन को व्यक्त करते हैं, और सेल छर्रों को जो एक ही स्लाइड में विभिन्न प्रजातियों से रुचि के प्रोटीन के ऑर्थोलॉग को व्यक्त करते हैं (चित्रा 3)। यह अभिकर्मकों के उपयोग को कम करते हुए, सभी सेल छर्रों को एक साथ तेजी से एक समान परिस्थितियों में मूल्यांकन करने की अनुमति देताहै।
इस प्रोटोकॉल के लिए आठ टी 175 फ्लास्क से एकत्र किए गए 2 एमएल की न्यूनतम प्रारंभिक सेल गोली मात्रा की सिफारिश की जाती है। यह मात्रा कई सेल पेलेट ब्लॉकों के उत्पादन और संग्रह की अनुमति देती है, ताकि सेल पेलेट नियंत्रण को लंबे समय तक मानकीकृत किया जा सके और किसी दिए गए गोली से कई सेल गोली सरणी बनाई जा सके। प्राथमिक रोगी-व्युत्पन्न सेल लाइनों, धीमी गति से बढ़ने वाली सेल लाइनों से निपटने के दौरान या जब स्थितियां नमूने की मात्रा को सीमित करती हैं, तो कम सेल गोली की मात्रा का उपयोग किया जा सकता है। बेशक, कम शुरुआती वॉल्यूम गोली के निर्धारण और तैयारी के दौरान किसी भी सेल हानि से नकारात्मक प्रभाव को शक्तिशाली करेगा और डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं के लिए उपलब्ध सामग्री को सीमित करेगा। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद फिक्सेटिव को हटाते समय ध्यान रखना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, ताकि किसी भी संबंधित नुकसान को कम किया जा सके। कम नमूना मात्रा के लिए, कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 1.5 एमएल, कैप्ड सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग किया जा सकता है। इन ट्यूबों को प्रसंस्करण के लिए ब्लेड के साथ अनुदैर्ध्य रूप से विभाजित किया जा सकता है।
ऊतक निर्धारण के समान, इस गोली के भीतर सेल निर्धारण डाउनस्ट्रीम आईएचसी आकलन के लिए महत्वपूर्ण है। पूर्ण निर्धारण प्राप्त करने के लिए, हम सेल पेलेट अनुपात में कम से कम 10: 1 फॉर्मलिन का उपयोग करते हैं और निलंबन में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए शंक्वाकार ट्यूब को उलट देते हैं। यदि निर्धारण के समय कोशिकाएं निलंबन में नहीं हैं, तो अपूर्ण या अपर्याप्त निर्धारण का खतरा है, जो डाउनस्ट्रीम इम्यूनोलेबलिंग को प्रभावित करेगा। अक्सर यह परिधि में मजबूत लेबलिंग और पेलेट के केंद्र में लेबलिंग के नुकसान या पूरे पेलेट में परिवर्तनीय तीव्रता के लेबलिंग के रूप में प्रकट होता है।
यह प्रोटोकॉल हिस्टोगेल का उपयोग करता है, जो मुख्य रूप से हाइड्रॉक्सीइथिल अगारोस से बना है, दोनों सेल गोली को बांधने और कोशिकाओं को पूरे सेल गोली में समान रूप से वितरित करने में सक्षम बनाने के लिए। इसके बिना, कोशिकाएं संकुचित हो जाती हैं और अपने साइटोमोर्फोलॉजिकल विवरण खो देती हैं। एंटीबॉडी स्क्रीनिंग के दौरान ये साइटोमोर्फोलॉजिकल विवरण अक्सर महत्वपूर्ण होते हैं, क्योंकि वे इस बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करते हैं कि एंटीबॉडी उपयुक्त उपकोशिकीय डिब्बे (जैसे, नाभिक, साइटोप्लाज्म या प्लाज्मा झिल्ली) में लेबलिंग कर रहा है या नहीं। इसके विपरीत, बहुत अधिक जेल के परिणामस्वरूप गोली के भीतर कम सेल घनत्व हो सकता है, जिससे कोशिकाओं को व्यापक रूप से वितरित किया जा सकता है, और प्रति खंड सेल संख्या कम हो सकती है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग नियमित रूप से आईएचसी नियंत्रण विकसित करने के लिए किया जा सकता है। इन छर्रों को बनाने के लिए आवश्यक सामग्री खोजी जीव विज्ञान और हिस्टोलॉजी प्रयोगशालाओं में आम हैं, और विधियां सरल और अनुकूलित करने में आसान हैं। जबकि सेल छर्रों में आईएचसी नियंत्रण के रूप में सीमाएं हैं, वे प्रारंभिक एंटीबॉडी स्क्रीनिंग के लिए महान उपकरण के रूप में काम करते हैं और अन्य ऊतक नियंत्रणों के पूरक होते हैं।
Disclosures
सभी लेखक जेनटेक / रोश के कर्मचारी हैं और, इस तरह, रोश में शेयरधारक हैं।
Acknowledgments
हम जेनटेक के अनुसंधान संगठन में हमारे सहयोगियों के सहयोग को स्वीकार करना चाहते हैं, और विशेष रूप से पैथोलॉजी कोर (पी-कोर) प्रयोगशालाओं ने वर्षों से इन तरीकों के विकास में योगदान दिया है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).
- Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma. American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).
- Cobleigh, M. A., et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).
- Vogel, C. L., et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).
- Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).
- Havnar, C., et al. Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson's trichrome. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).
- Newton, K., et al. RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development. Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).
- Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling. Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).
- Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach. Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).
- Ramos-Vara, J. A., et al. American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).
- Dominguez, S., et al. Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).
- Lean, F. Z. X., et al. Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization. Transboundary and Emerging Disease. , 14232 (2021).
- Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies. Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).
- Atcc.org. , Available from: http://www.atcc.org (2022).
- Thermo Fisher Scientific. Cell Culture Basics Handbook. , Gibco. (2020).
- Carson, F. Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed. , ASCP Press. Chicago, IL. (1997).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Tissue Processing. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed. Spencer, L. T., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone-Elsevier. China. (2013).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. Cancer Gene Profiling. , Humana Press. New York. 53-65 (2016).
- Jinek, M., et al. Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).
- Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology. Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).
