Analisi dell'autofagia indotta dalla fame nel corpo grasso larvale di Drosophila melanogaster
Summary
Il presente protocollo descrive l’induzione dell’autofagia nel corpo grasso larvale della Drosophila melanogaster attraverso l’esaurimento dei nutrienti e analizza i cambiamenti nell’autofagia utilizzando ceppi di mosca transgenici.
Abstract
L’autofagia è un processo di autodigestione cellulare. Trasporta il carico ai lisosomi per la degradazione in risposta a vari stress, tra cui la fame. Il malfunzionamento dell’autofagia è associato all’invecchiamento e a molteplici malattie umane. Il macchinario dell’autofagia è altamente conservato, dal lievito all’uomo. Il corpo grasso larvale di Drosophila melanogaster, un analogo per il fegato dei vertebrati e il tessuto adiposo, fornisce un modello unico per il monitoraggio dell’autofagia in vivo. L’autofagia può essere facilmente indotta dalla fame di nutrienti nel corpo grasso larvale. La maggior parte dei geni correlati all’autofagia sono conservati in Drosophila. Sono stati sviluppati molti ceppi di mosche transgeniche che esprimono marcatori autofagici marcati, il che facilita il monitoraggio di diverse fasi del processo di autofagia. L’analisi clonale consente un confronto ravvicinato dei marcatori di autofagia in cellule con genotipi diversi nello stesso pezzo di tessuto. L’attuale protocollo descrive le procedure per (1) generare cloni somatici nel corpo grasso larvale, (2) indurre l’autofagia attraverso la fame di aminoacidi e (3) sezionare il corpo grasso larvale, con l’obiettivo di creare un modello per analizzare le differenze nell’autofagia utilizzando un marcatore autofagosomico (GFP-Atg8a) e l’analisi clonale.
Introduction
L’autofagia è un processo di “auto-alimentazione” indotto da vari stress, tra cui la fame di aminoacidi1. La macroautofagia (di seguito denominata autofagia) è il tipo più studiato di autofagia e svolge un ruolo insostituibile nel mantenimento dell’omeostasi cellulare2. Il malfunzionamento dell’autofagia è associato a diverse malattie umane3. Inoltre, alcuni geni correlati all’autofagia sono potenziali bersagli per il trattamento di varie malattie4.
L’autofagia è regolata in modo altamente sofisticato5. Dopo la fame, le membrane di isolamento sequestrano materiali citoplasmatici per formare autofagosomi a doppia membrana6. Gli autofagosomi si fondono quindi con endosomi e lisosomi per formare anfisomi e autolisosomi. Con l’aiuto degli enzimi idrolitici lisosomiali, il contenuto citoplasmatico inghiottito viene degradato e i nutrienti vengono riciclati7.
L’autofagia è un processo evolutivamente conservato8. Drosophila melanogaster è un ottimo modello per studiare il processo di autofagia in vivo. La fame di aminoacidi induce facilmente l’autofagia nel tessuto corporeo grasso della mosca, un analogo del fegato umano e del tessuto adiposo9. I difetti nell’autofagia interrompono i distinti schemi di punteggiatura di diverse proteine correlate all’autofagia, come Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 e p62, tra gli altri10. Pertanto, l’analisi dei modelli di questi marcatori di autofagia aiuterà a discernere il verificarsi di difetti di autofagia e la fase di autofagia difettosa. Ad esempio, la proteina simile all’ubiquitina Atg8 è il marcatore di autofagia11 più comunemente usato. In Drosophila melanogaster, sono stati sviluppati con successo ceppi transgenici con una proteina fluorescente verde (GFP) Atg8a12. GFP-Atg8a è diffuso nel citosol e nei nuclei delle cellule alimentate. Dopo la fame, GFP-Atg8a viene elaborato e modificato dalla fosfatidiletanolammina (PE) e forma puncta, che etichetta le membrane di isolamento e gli autofagosomi completamente sviluppati13,14. Attraverso la microscopia a fluorescenza diretta, l’induzione dell’autofagia può essere facilmente osservata come un aumento della formazione di GFP-Atg8 puncta15. Atg8a puncta non si formerebbe in risposta alla fame in presenza di un difetto di iniziazione dell’autofagia. Poiché GFP-Atg8a può essere estinto e digerito dal basso pH negli autolisosomi, GFP-Atg8a puncta può aumentare di numero se l’autofagia viene bloccata nelle fasi avanzate16.
Poiché l’autofagia è altamente sensibile alla disponibilità nutrizionale17, lievi differenze nelle condizioni di coltura spesso portano a variazioni nei fenotipi. Pertanto, l’analisi clonale, un metodo che analizza le cellule mutanti rispetto alle cellule di controllo wild-type nello stesso tessuto, ha un grande vantaggio nel sezionare i difetti dell’autofagia18. Sfruttando la ricombinazione sito-specifica mediata da flippasi/flippasi (FLP/FRT) tra cromosomi omologhi, i moscerini che trasportano tessuti a mosaico sono prontamente realizzati 19,20. Le cellule wild-type che circondano le cellule mutanti formano un perfetto controllo interno per evitare differenze individuali21.
Il presente studio descrive come indurre l’autofagia per fame di aminoacidi e generare tessuti del grasso corporeo a mosaico che esprimono GFP-Atg8a. Questi protocolli possono essere utilizzati per analizzare le differenze nell’autofagia tra i cloni mutanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo descrive i metodi per (1) generare mosche che trasportano cloni mutanti nei corpi grassi larvali, (2) indurre l’autofagia attraverso la fame di aminoacidi e (3) sezionare i corpi grassi larvali. Per generare cloni con successo nei corpi grassi larvali, i seguenti passaggi critici devono essere eseguiti diligentemente. (1) La tempistica accurata dello shock termico è fondamentale perché la ricombinazione mitotica avviene solo quando il tessuto è sottoposto a mitosi e (2) sia la temperatura che la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a THFC e BDSC per aver fornito le varietà di mosche. Il Dr. Tong Chao è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) e dai fondi di ricerca fondamentale per le università centrali. Ringraziamo la struttura principale del Life Sciences Institute (LSI) per la fornitura di servizi.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
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