Анализ аутофагии, вызванной голоданием, в личиночном жировом теле Drosophila melanogaster
Summary
В настоящем протоколе описывается индукция аутофагии в жировом теле личинки Drosophila melanogaster посредством истощения питательных веществ и анализируются изменения в аутофагии с использованием трансгенных штаммов мух.
Abstract
Аутофагия — это процесс клеточного самопереваривания. Он доставляет груз к лизосомам для деградации в ответ на различные стрессы, в том числе и на голодание. Нарушение аутофагии связано со старением и множественными заболеваниями человека. Механизм аутофагии очень консервативен – от дрожжей до человека. Личиночное жировое тело Drosophila melanogaster, аналог печени и жировой ткани позвоночных, представляет собой уникальную модель для мониторинга аутофагии in vivo. Аутофагия может быть легко вызвана питательным голоданием в личиночном жировом теле. Большинство генов, связанных с аутофагией, сохраняются у дрозофилы. Было разработано много трансгенных штаммов мух, экспрессирующих меченые маркеры аутофагии, что облегчает мониторинг различных этапов процесса аутофагии. Клональный анализ позволяет провести тщательное сравнение маркеров аутофагии в клетках с разными генотипами в одном и том же фрагменте ткани. В текущем протоколе подробно описаны процедуры (1) генерации соматических клонов в личиночном жировом теле, (2) индуцирования аутофагии посредством аминокислотного голодания и (3) вскрытия личиночного жирового тела с целью создания модели для анализа различий в аутофагии с использованием маркера аутофагосом (GFP-Atg8a) и клонального анализа.
Introduction
Аутофагия — это процесс «самопоедания», вызванный различными стрессами, включая аминокислотное голодание1. Макроаутофагия (далее именуемая аутофагией) является наиболее хорошо изученным типом аутофагии и играет незаменимую роль в поддержании клеточного гомеостаза2. Нарушение аутофагии связано с несколькими заболеваниями человека3. Кроме того, некоторые гены, связанные с аутофагией, являются потенциальными мишенями для лечения различных заболеваний4.
Аутофагия регулируется очень сложным образом5. При голодании изоляционные мембраны изолируют цитоплазматические материалы с образованием двухмембранных аутофагосом6. Затем аутофагосомы сливаются с эндосомами и лизосомами, образуя амфисомы и аутолизосомы. С помощью лизосомальных гидролитических ферментов поглощенное цитоплазматическое содержимое разлагается, а питательные вещества перерабатываются7.
Аутофагия является эволюционно консервативным процессом8. Drosophila melanogaster является отличной моделью для изучения процесса аутофагии in vivo. Аминокислотное голодание легко индуцирует аутофагию в жировой ткани тела мухи, аналог печени и жировой тканичеловека 9. Дефекты аутофагии нарушают отчетливые паттерны точек нескольких белков, связанных с аутофагией, таких как Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 и p62, среди других10. Таким образом, анализ паттернов этих маркеров аутофагии поможет различить возникновение дефектов аутофагии и стадию дефектной аутофагии. Например, убиквитин-подобный белок Atg8 является наиболее часто используемым маркером аутофагии11. У Drosophila melanogaster были успешно выведены трансгенные штаммы с зеленым флуоресцентным белком (GFP)-меченым Atg8a12. GFP-Atg8a диффундирует в цитозоль и ядра питаемых клеток. При голодании GFP-Atg8a обрабатывается и модифицируется фосфатидилэтаноламином (ПЭ) и образует пункты, которые маркируют изоляционные мембраны и полностью развитые аутофагосомы13,14. С помощью прямой флуоресцентной микроскопии можно легко наблюдать индукцию аутофагии в виде увеличения образования точек GFP-Atg815. Atg8a puncta не образуется в ответ на голодание при наличии дефекта инициации аутофагии. Поскольку GFP-Atg8a может гаситься и перевариваться при низком рН в аутолизосомах, GFP-Atg8a puncta может увеличиваться в количестве, если аутофагия блокируется на поздних стадиях16.
Поскольку аутофагия очень чувствительна к доступности питания17, небольшие различия в условиях культивирования часто приводят к различиям в фенотипах. Таким образом, клональный анализ, метод, который анализирует мутантные клетки по сравнению с контрольными клетками дикого типа в той же ткани, имеет большое преимущество в анализе дефектов аутофагии18. Используя преимущества мишени распознавания флиппазы / флиппазы (FLP / FRT), опосредованной сайт-специфической рекомбинацией между гомологичными хромосомами, мухи, несущие мозаичные ткани, легко получаются19,20. Клетки дикого типа, окружающие мутантные клетки, образуют идеальный внутренний контроль, позволяющий избежать индивидуальных различий21.
В настоящем исследовании описывается, как индуцировать аутофагию путем аминокислотного голодания и генерировать мозаичные жировые ткани тела, экспрессирующие GFP-Atg8a. Эти протоколы могут быть использованы для анализа различий в аутофагии среди мутантных клонов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем протоколе описаны способы (1) получения мух, несущих мутантные клоны в личиночных жировых телах, (2) индуцирования аутофагии посредством аминокислотного голодания и (3) препарирования личиночных жировых тел. Чтобы успешно генерировать клоны в личиночных жировых телах, необхо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны THFC и BDSC за предоставление штаммов мух. Доктор Тун Чао поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (32030027, 91754103, 92157201) и фондами фундаментальных исследований для центральных университетов. Мы благодарим основное учреждение Института наук о жизни (LSI) за предоставление услуг.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
- Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
- Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
- Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
- Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes…Wait,I’mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
- Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
- Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
- Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
- Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
- Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
- Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
- Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
- Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
- Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
- Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
- Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It’s more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
- Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
- Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
- Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
- Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux’s Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
- Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
- Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
- Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
- Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
- Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
- Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).
