Préparation d’une suspension cellulaire non cardiomyocytaire pour le séquençage d’ARN unicellulaire à partir d’un cœur de souris adulte post-infarctus du myocarde
Summary
Ici, nous décrivons un protocole pour isoler une quantité suffisante de non-cardiomyocytes uniques avec une viabilité élevée d’un cœur de souris post-infarctus du myocarde (IM). Cela peut être utilisé pour le séquençage ultérieur d’une seule cellule, l’analyse de cytométrie en flux et la culture cellulaire primaire.
Abstract
L’infarctus du myocarde (IM) est l’une des maladies cardiovasculaires les plus courantes, avec une mortalité croissante dans le monde entier. Les non-cardiomyocytes représentent plus de la moitié de la population totale de cellules cardiaques et contribuent aux compensations adaptatives en cas de lésion myocardique, y compris les réponses inflammatoires, la réparation des tissus et la formation de cicatrices. Pour étudier le microenvironnement cardiaque post-MI, le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) est largement utilisé pour identifier différents types de cellules cardiaques et les communications intercellulaires. Parmi les procédures de préparation de l’échantillon scRNA-seq, la préparation de la suspension cellulaire est l’une des étapes les plus critiques, car la viabilité cellulaire peut affecter la qualité des résultats scRNA-seq. Par conséquent, nous avons conçu un protocole expérimental pour la préparation d’une suspension cellulaire non cardiomyocytaire à partir de cœurs de souris post-MI avec un accent supplémentaire sur l’amélioration de la viabilité cellulaire en choisissant des enzymes digestives douces, en contrôlant le temps de digestion et en appliquant un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Enfin, nous avons isolé des cellules CD45+ à partir de la suspension cellulaire non cardiomyocytaire obtenue grâce à ce protocole, puis nous avons effectué scRNA-seq.
Introduction
L’infarctus du myocarde (IM) est l’une des maladies cardiovasculaires les plus courantes, et sa mortalité augmente dans le mondeentier 1. L’IM est causée par un apport sanguin insuffisant au myocarde environnant, qui peut être le résultat d’un blocage de l’artère coronaire qui se produit avec la rupture de la plaque d’athérosclérose. Bien que l’intervention coronarienne percutanée (ICP) ait réduit les taux de mortalité des patients atteints d’IM aigu, la prévalence élevée de l’insuffisance cardiaque après l’IM reste un problème2. La physiopathologie clé sous-jacente à l’insuffisance cardiaque post-IM est la réponse compensatoire du corps aux lésions cardiaques, qui consiste à remplacer le muscle cardiaque mort par des cicatrices fibrotiques non contractiles. Ces réponses adaptatives reposent de manière significative sur l’inflammation locale médiée par les interactions entre plusieurs types de cellules et les cellules du tissu cardiaque, et cette inflammation est maintenant considérée comme une cible thérapeutique potentielle pour réduire la formation de cicatrices fibrotiques et, ainsi, protéger contre l’insuffisance cardiaque post-IM 3,4. Fait intéressant, le microenvironnement au site de l’infarctus connaît une transition dépendante du temps dans les types de cellules infiltrantes et fonctionne à différents stades de MI 1,5. De nombreuses études ont montré que les non-cardiomyocytes (p. ex. cellules immunitaires, fibroblastes et cellules endothéliales) jouent un rôle central dans l’inflammation post-IM et la réparation des tissus 5,6. Ces dernières années, le séquençage unicellulaire a été largement utilisé comme un outil puissant pour élucider les implications et les fonctions des non-cardiomyocytes dans le microenvironnement post-MI 7,8. Cela donne un aperçu de la physiopathologie des blessures et des réparations post-IM et du développement de thérapies potentielles contre l’insuffisance cardiaque post-IM.
Le séquençage d’ARN à haut débit (RNA-Seq) est une technique utilisée pour étudier en détail des transcriptomes entiers à l’aide du séquençage de nouvelle génération (NGS)7,8,9. Récemment, le développement de scRNA-Seq a révolutionné le domaine de la recherche biomédicale. Par rapport au séquençage en vrac conventionnel, scRNA-Seq analyse les profils d’expression génique et l’hétérogénéité transcriptionnelle au niveau de la cellule unique 7,8. Cette technique favorise de manière significative la recherche sur la physiopathologie cellulaire de l’IM 9,10 en identifiant différents types de cellules circulantes dans le microenvironnement post-MI et en découvrant l’interaction entre les cardiomyocytes et les non-cardiomyocytes. Ces résultats contribuent également à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour l’insuffisance cardiaque post-IM. En général, l’expérience post-MI basée sur scRNA-seq comprend trois sections principales: (1) l’établissement d’un modèle animal post-MI; 2° la préparation de la suspension cellulaire; et (3) le séquençage des échantillons et l’analyse des données. Il est à noter que la préparation de la suspension cellulaire est l’étape la plus critique dans la préparation de l’expérience scRNA-Seq, car la qualité de la suspension cellulaire détermine la précision des résultats.
Ce protocole est conçu pour extraire une suspension cellulaire non cardiomyocytaire du tissu cardiaque post-IM; De manière significative, les détails spécifiques pour maintenir la viabilité et la résolution de la cellule sont inclus. Pendant ce temps, les équipements utilisés dans ce protocole, tels que les kits chirurgicaux pour souris, les ventilateurs pour rongeurs et les centrifugeuses, peuvent être trouvés dans la plupart des centres d’expérimentation animale et des laboratoires biomédicaux, et, par conséquent, le coût de l’expérience de ce protocole est relativement faible. De plus, si l’on considère les points temporels et les sites d’infarctus comme variables, ce protocole peut être appliqué pour simuler un large éventail de scénarios cliniques, en particulier pour les complications post-IM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article visait à décrire un protocole pour isoler des non-cardiomyocytes uniques de cœurs de souris après l’IM. Le protocole peut être appliqué pour isoler différents types de cellules dans le microenvironnement post-MI avec une haute qualité, y compris les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et les fibroblastes. Trois facteurs essentiels sont cruciaux pour obtenir une suspension cellulaire de haute qualité pour le séquençage unicellulaire. Le premier est le réglage de la digestion enzyma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Fonds des sciences naturelles de la province du Zhejiang (LQ22H020010).
Materials
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
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