בדיקת קשירה של חלבון פני התא המבוסס על ציטומטריה של זרימה להערכת סלקטיביות וספציפיות של אפטמר אנטי-סרטני
Summary
צעד הכרחי בפיתוח אפטמר נגד סרטן הוא לבחון את קשירתו למטרה. אנו מדגימים בדיקה מבוססת ציטומטריה של זרימה כדי לחקור את הקשירה הזו, תוך הדגשת החשיבות של הכללת אפטמר בקרה שלילית ותאים סרטניים חיוביים או שליליים עבור אותו חלבון מסוים.
Abstract
אתגר מרכזי בפיתוח אפטמר נגד סרטן הוא לקבוע ביעילות את הסלקטיביות והספציפיות של האפטמר המפותח לחלבון המטרה. בשל יתרונותיו הרבים על פני נוגדנים חד שבטיים, פיתוח אפטמר זכה לפופולריות עצומה בקרב חוקרי סרטן. אבולוציה שיטתית של ליגנדות על ידי העשרה מעריכית (SELEX) היא השיטה הנפוצה ביותר לפיתוח אפטמרים ספציפיים לחלבונים בעלי עניין. בעקבות SELEX, בדיקת קשירה מהירה ויעילה מאיצה את תהליך הזיהוי, ומאשרת את הסלקטיביות והספציפיות של האפטאמר.
מאמר זה מסביר שלב אחר שלב בדיקת קשירה מבוססת ציטומטריה של אפטמר ספציפי למולקולת הידבקות תאית אפיתל (EpCAM). הגליקופרוטאין EpCAM של טרנסממברנה מתבטא יתר על המידה ברוב הקרצינומות וממלא תפקידים בייזום סרטן, התקדמות וגרורות. לכן, הוא מועמד בעל ערך למתן תרופות ממוקדות לגידולים. כדי להעריך את הסלקטיביות והספציפיות של האפטמר ל- EpCAM הקשור לממברנה, נדרשים תאים חיוביים ושליליים של EpCAM. בנוסף, נדרש אפטמר EpCAM לא מחייב עם אורך דומה ומבנה דו-ממדי (2D) לאפטמר מחייב EpCAM. בדיקת האיגוד כוללת מאגרים שונים (מאגר חוסם, מאגר כביסה, מאגר דגירה ומאגר FACS) ושלבי דגירה.
האפטמר הוא דגירה עם קווי התא. לאחר שלבי הדגירה והשטיפה, התאים יוערכו באמצעות בדיקת ציטומטריה של זרימה רגישה. ניתוח התוצאות מראה את הקישור של האפטמר הספציפי ל- EpCAM לתאים חיוביים ל- EpCAM ולא לתאים השליליים של EpCAM. בתאים חיוביים ל-EpCAM, זה מתואר כהזזת פס בכריכה של אפטמר EpCAM מימין בהשוואה לבקרת האפטאמר הלא מחייבת. בתאים שליליים של EpCAM, הרצועות המתאימות של אפטמרים קושרי EpCAM ו–לא-מחייבים חופפים. זה מדגים את הסלקטיביות והספציפיות של אפטאמר EpCAM. בעוד שפרוטוקול זה מתמקד באפטמר EpCAM, הפרוטוקול חל על אפטאמרים אחרים שפורסמו.
Introduction
סרטן הוא עדיין אחד הגורמים המובילים לתמותה ברחבי העולם1. למרות השיפור המשמעותי בטיפול בסרטן בעשורים האחרונים, פיתוח תרופות נגד סרטן הוא עדיין נושא שנוי במחלוקת. הסיבה לכך היא שכימותרפיה, כעמוד התווך של הטיפול בסרטן, מלווה בתופעות לוואי חמורות המגבילות את ציות המטופל לטיפול. יתר על כן, עמידות לסרטן הנגרמת על ידי כימותרפיה לטיפול הגבילה את יישומו כבחירה היחידה של התערבות רפואית. היישום של נוגדנים חד שבטיים (mAbs) הציג תגובה משופרת לטיפולים בסרטן2. הרציונל של השימוש ב-mAbs היה לשפר את היעילות של כימותרפיה ולמזער את התגובות השליליות שלהם. עם זאת, הממשל של mAbs הפך גם אתגר. זה היה לא רק בגלל התגובות החיסוניות הנגרמות על ידי mAb, אלא גם בגלל עלויות הייצור התלויות והיקרות של בעלי חיים ותנאי אחסון קשים3. הצגת האפטמרים בשנות ה-90 של המאה ה-20העלתה תקוות חדשות בטיפול בסרטן, שכן היישום של אפטמרים יכול היה להתמודד עם האתגרים הקשורים ל-mAbs.
אפטמרים הם רצפי חומצות גרעין קצרים המיוצרים במיוחד עבור מטרה מסוימת. אבולוציה שיטתית של ליגנדות על ידי העשרה אקספוננציאלית (SELEX) היא שיטה נפוצה בייצור אפטמרים. ב-SELEX, החלבון המעניין מודגר עם ספרייה של רצפי נוקלאוטידים אקראיים, ובאמצעות סדרה של מחזורים איטרטיביים, האפטמר הספציפי לחלבון זה מטוהר. ל-Aptamers יש סלקטיביות מטרה וספציפיות דומות ל-mAbs, ולכן פיתוח תרופות בתחום זה מראה יישומים עתידיים מבטיחים. Aptamers ספציפיים עבור סמנים ביולוגיים לסרטן יכול להיות מיושם כתרופות בודדות וכלי אבחון סרטן 5,6,7. בשל המבנה הננו-גדול שלהם, אפטמרים אלה יכולים לשמש גם כנשאי תרופות כדי לספק חומרים ציטוטוקסיים במיוחד לגידול8. זה יגביר את היעילות של מתן תרופות ממוקדות ויפחית את התגובות השליליות הקשורות לכימותרפיה, מחוץ למטרה. יתר על כן, לננו-רפואה אלה יש חדירה גבוהה לרקמות, מה שהופך אותם למועמדים רצויים להעברת תרופות וטיפול בגידולים עמוקים. ניתן גם לתכנן את האפטמרים כך שיתמקדו במובילים המתבטאים במחסום הדם-מוח (BBB) כדי לשפר את אספקת התרופות לגידולי מוח9. דוגמה טובה לאפטמר כזה הם אפטמרים דו-כיווניים, המכוונים לקולטן טרנספרין (TfR)10 כדי לשפר את אספקת התרופות ברחבי ה-BBB, ומעבירים מטען של תרופה ציטוטוקסית לתאי הגידול11.
למרות כל היתרונות של אפטמרים, פיתוח תרופות בתחום זה עדיין לא הניב תרופה משווקת ומוצלחת נגד סרטן. סיבה אחת לכך יכולה להיות היעדר שיטות סטנדרטיות וניתנות לשחזור שניתן לעקוב אחריהן ברחבי העולם על ידי חוקרים בתחום. במאמר זה מודגם פרוטוקול שלב אחר שלב של קשירת אפטמר לחלבון מקומי המתבטא על פני התא. פרוטוקול זה הוא שלב מוקדם בהערכה הפרה-קלינית של אפטמרים נגד סרטן. הבדיקה מבוצעת כדי להראות את הסלקטיביות והספציפיות של האפטמר המטוהר שנאסף מ- SELEX או רצף אפטמר שפורסם לאישור סלקטיביות וספציפיות. בדיקה זו, המבוססת על ציטומטריה, היא בדיקה מהירה, אמינה ורגישה המציגה במדויק את הסלקטיביות והספציפיות של האפטאמר, כאשר האפטמר נבדק מול חלבונים על פני התא12,13,14. שיטה זו מודגמת באמצעות כריכה של aptamer ספציפי עבור EpCAM המוצג במאמר זה15. EpCAM, כגליקופרוטאין טרנסממברן, ממלא תפקידים באיתות תאי הגידול, התקדמות, נדידה וגרורות16,17. כדי להראות את הסלקטיביות והספציפיות של אפטמר זה, נעשה שימוש בתאי סרטן חיוביים ושליליים של EpCAM. האפטאמר הספציפי של EpCAM שפותח בעבר, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), ואפטמר בקרה שלילית, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), שימשו כמחייבים EpCAM ו–לא מחייבים aptamers, בהתאמה10. הקצה 3′ של TEPP ו- TENN סומנו עם פלואורופור TYE665.
TEPP הוא אפטמר דו-תכליתי המכוון ל-EpCAM מקצה אחד ול-TfR מצד שני. עובדה זו הפכה את TEPP למועמדת מתאימה לאספקת תרופות לגידולי מוח מסוג EpCAM+ . באמצעות הקצה הספציפי ל-TfR, TEPP חוצה את מחסום הדם-מוח, ובאמצעות הקצה הספציפי ל-EpCAM, מוצא את הגידול ומעביר את המטען שלו (למשל, תרופות ציטוטוקסיות) לגידול. ל- TENN יש אורך ומבנה דו-ממדי דומה לזה של TEPP, אך אין לו זיקה ל- EpCAM או TfR, ולכן הוא אפתמר מתאים לבקרה שלילית. באמצעות TEPP ו- TENN, בדיקת קשירת אפטמר לחלבון המטרה באמצעות ציטומטריה של זרימה מוצגת במאמר זה. פרוטוקול זה חל על פיתוח של aptamers ספציפיים לתא. הוא ישים גם לניתוחים משלימים ומאשרים נוספים של רצפי האפטמרים הזמינים בספרות. הפרוטוקול יכול לשמש גם את אלה החדשים בתחום האפטמר אשר בוחנים שימוש באפטמר שפורסם בעבר למטרות המחקר והפיתוח (מו”פ) שלהם. במאמר זה נלמדים שני רצפי אפטאמרים הזמינים בספרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
האתגר המרכזי בפיתוח אפטמרים חדשים הוא היעדר הנחיות סטנדרטיות החלות על שלבים שונים בתהליך זה. McKeague et al. הדגימו לאחרונה כמה מהאתגרים הנלווים, שמובילים להצגה לא ברורה של נתונים בפרסומים ואי שכפול המחקר. הם הציעו קווים מנחים יסודיים הדרושים לשיקול באפיון אפטאמרים19. בדיקת קשירת א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים במימון SEED של המכון לבריאות נפשית ופיזית ותרגום קליני (IMPACT), בתוכנית “מלגת מחקר פוסט-דוקטורט ע”ש אלפרד דיקין” באוניברסיטת דיקין, וב”מלגת תוכנית ההכשרה למחקר של ממשלת אוסטרליה”.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
References
- Cancer. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022)
- Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development – Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
- Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).
- Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).
- Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322 (2015).
- Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
- Huang, J., et al. Advances in aptamer-based biomarker discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).
- Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
- Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
- Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
- Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).
- Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070 (2017).
- Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).
- Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).
- Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
- Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
- McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. . Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
- Schoofs, G., Van Hout, A., D’huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).
- McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
- Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
- Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
- McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
- Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).
- Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
- Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
- Yu, X. -. X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).
