JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

تقييم تنشيط الكاسباز لتقييم موت الخلايا المناعية الفطرية

Published: January 20, 2023
doi:
10.3791/64308
, ,
1Department of Immunology,St. Jude Children’s Research Hospital

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة شاملة لتقييم تنشيط الكاسباز (caspase-1 و caspase-3 و caspase-7 و caspase-8 و caspase-9 و caspase-11) استجابة لكل من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي (في الفئران) للعدوى والشتائم العقيمة والسرطان لتحديد بدء مسارات موت الخلايا ، مثل pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، necroptosis ، و PANoptosis.

Abstract

توفر المناعة الفطرية خط الدفاع الأول الحاسم استجابة لمسببات الأمراض والإهانات العقيمة. أحد المكونات الميكانيكية الرئيسية لهذه الاستجابة هو بدء موت الخلايا المبرمج المناعي الفطري (PCD) للقضاء على الخلايا المصابة أو التالفة ونشر الاستجابات المناعية. ومع ذلك ، يرتبط PCD الزائد بالالتهاب وعلم الأمراض. لذلك ، فإن فهم تنشيط وتنظيم PCD هو جانب مركزي لتوصيف الاستجابات المناعية الفطرية وتحديد أهداف علاجية جديدة عبر طيف المرض.

يوفر هذا البروتوكول طرقا لتوصيف تنشيط PCD المناعي الفطري من خلال مراقبة caspases ، وهي عائلة من البروتياز المعتمد على السيستين والتي غالبا ما ترتبط بمسارات PCD المتنوعة ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، pyroptosis ، necroptosis ، و PANoptosis. وصفت التقارير الأولية caspase-2 و caspase-8 و caspase-9 و caspase-10 على أنها كاسباس بادئ و caspase-3 و caspase-6 و caspase-7 ككاسباز مستجيب في موت الخلايا المبرمج ، بينما وجدت الدراسات اللاحقة أن caspases الالتهابية ، caspase-1 ، caspase-4 ، caspase-5 ، و caspase-11 ، تدفع pyroptosis. من المعروف الآن أن هناك تقاطعا مكثفا بين الكاسباس وجزيئات المناعة وموت الخلايا الفطرية الأخرى عبر مسارات PCD المحددة سابقا ، مما يحدد فجوة معرفية رئيسية في الفهم الميكانيكي للمناعة الفطرية و PCD ويؤدي إلى توصيف PANoptosis. PANoptosis هو مسار التهابي فطري فريد من نوعه ينظمه مجمعات PANoptosome ، والتي تدمج المكونات ، بما في ذلك caspases ، من مسارات موت الخلايا الأخرى.

هنا ، يتم توفير طرق لتقييم تنشيط caspases استجابة للمنبهات المختلفة. تسمح هذه الطرق بتوصيف مسارات PCD في كل من المختبر والجسم الحي ، حيث تخضع الكاسباز المنشطة لانقسام بروتيني يمكن تصوره عن طريق النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة المثلى وظروف النشاف. تم إنشاء بروتوكول وتدفق عمل النشاف الغربي الذي يسمح بتقييم تنشيط كاسباز متعددة من نفس المجموعة الخلوية ، مما يوفر توصيفا شاملا لعمليات PCD. يمكن تطبيق هذه الطريقة عبر مجالات البحث في التنمية ، والتوازن ، والعدوى ، والالتهابات ، والسرطان لتقييم مسارات PCD عبر العمليات الخلوية في الصحة والمرض.

Introduction

يعمل جهاز المناعة الفطري كخط دفاع أول أثناء العدوى واستجابة للمثيرات العقيمة، مثل إصابة الأنسجة والتغيرات في الاتزان الداخلي. تستجيب المستشعرات المناعية الفطرية على سطح الخلية وفي السيتوبلازم للأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض أو الضرر (PAMPs أو DAMPs ، على التوالي) لتحفيز مسارات الإشارات الالتهابية والاستجابات الخلوية. تتمثل إحدى العمليات الرئيسية للاستجابة المناعية الفطرية في تحريض موت الخلايا لإزالة الخلايا المصابة أو التالفة وتحفيز المزيد من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. موت الخلايا المبرمج (PCD) هو عملية محفوظة للغاية عبر الأنواع ، مما يسلط الضوء على أهميتها التطورية كآلية مناعية فطرية.

هناك العديد من مسارات PCD المناعية الفطرية التي يمكن تنشيطها في جميع أنواع الخلايا. Caspases هي عائلة رئيسية من البروتياز المحفوظة للغاية ، داخل الخلايا ، والتي تعتبر حاسمة عبر العديد من مسارات PCD ، بما في ذلك مسار موت الخلايا المبرمج غير الالتهابي تقليديا ، بالإضافة إلى مسارات PCD الالتهابية مثل pyroptosis و necroptosis و PANoptosis1،2،3،4،5 . هناك 11 كاسباس بشري و 10 فأر محددة جيدا ، بالإضافة إلى كاسباس زائف قد يكون وظيفيا ، ويتم التعبير عن معظمها بشكل أساسي على أنها أحادي غير نشط أو ثنائي الكاسباز المؤيد للكاسباس الذي يتطلب انقساما للتنشيط 6,7. تحتوي Caspases أيضا على مجالات مهمة لتجنيد وتشكيل مجمعات متعددة البروتينات. وتشمل هذه المجالات مجال التنشيط والتوظيف caspase (CARD) ، والذي يمكن العثور عليه في caspase-1 و caspase-2 و caspase-4 و caspase-5 و caspase-9 و caspase-11 ، أو مجال مستجيب الموت (DED) ، الموجود في caspase-8 و caspase-10. من خلال كل من نشاطها المحلل للبروتين وقدرتها على تكوين مجمعات متعددة البروتينات ، تعد الكاسباز محركات حاسمة ل PCD المناعي الفطري.

تم تحديد دور caspases في PCD المناعي الفطري لأول مرة في موت الخلايا المبرمج ، حيث يقوم caspases البادئ ، caspase-2 ، caspase-8 ، caspase-9 ، و caspase-10 ، بتنشيط caspases الجلاد ، caspase-3 ، caspase-6 ، و caspase-7 ، لدفع موت الخلايا8،9،10،11،12. يمكن تنشيط كاسباس البادئ بواسطة شلالات إشارات متنوعة ؛ ينشط المسار الخارجي Caspase-8 من خلال إشارات مستقبلات الموت التي يسببها الرباط خارج الخلية ، وينشط المسار الداخلي Caspase-9 من خلال تعطيل سلامة الميتوكوندريا13. تقوم كاسباس البادئ المنشط بشق الرابط الذي يفصل بين الوحدات الفرعية التحفيزية الكبيرة والصغيرة لكاسباس الجلاد لإنتاج أشكالها النشطة. ثم يقوم الجلاد بشق ركائزه لتفكيك الخلية ، مما يؤدي إلى تدهور الحمض النووي ، وتفجير الغشاء ، والتجزئة النووية ، وإطلاق أجسام موت الخلايا المبرمج14,15. تنتهي هذه العملية عادة بشكل غير لاتيني وغير التهابي من موت الخلايا عندما تقترن بالإزالة الفورية للخلايا الميتة عن طريق كثرة الخلايا الفعالة16. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي العيوب في كثرة الخلايا أو نقص الخلايا البلعمية إلى تراكم الخلايا المبرمج ، والتي تخضع بعد ذلك لموت الخلايا الانحلالية والالتهابية17,18.

تم اكتشاف أن الكاسباس الالتهابي ، بما في ذلك caspase-1 (الإنسان والفأر) ، caspase-4 و caspase-5 (الإنسان) ، و caspase-11 (الفأر) ، يتم تنشيطه خلال شكل من أشكال التهاب المناعة الفطرية PCD (III-PCD) يسمى pyroptosis. يرتبط تنشيط Caspase-1 بتكوين الالتهابات ، وهي مجمعات متعددة البروتينات تحتوي على مستشعر مناعي فطري خلوي ، وجزيء محول (بروتين شبيه بالبقع مرتبط بموت الخلايا المبرمج يحتوي على CARD [ASC]) ، و caspase-1. يسمح تكوين هذا المركب للكاسباز -1 بالخضوع للتحلل الذاتي بوساطة القرب لإطلاق شكله النشط ، والذي يمكن أن يشق الركائز المستهدفة بما في ذلك السيتوكينات المؤيدة للالتهابات إنترلوكين (IL) -1β و IL-18 وجزيء Gasdermin D المكون للمسام (GSDMD) 19،20،21،22،23 . يمكن ل Caspase-11 و caspase-4 و caspase-5 أيضا تنشيط GSDMD دون تكوين المنبع للالتهابات بعد استشعار PAMPs مثل عديد السكاريد الدهني (LPS) 19,20. تخضع هذه الكاسباز للتثبيط متبوعا بقليل القلة والانقسام الذاتي للتنشيط عند الارتباط ب LPS الخلوي ، مما يؤدي إلى تنشيط التهابي غير قانوني 24،25،26 وتنشيط caspase-1 بطريقة جوهرية للخلية للحث على نضوج IL-1β و IL-1820. إن نضوج وإطلاق هذه السيتوكينات المؤيدة للالتهابات يميز هذه الكاسباس بأنها “التهابية”. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على كاسباز -8 موت الخلايا المبرمج لتوطين إلى الالتهاب ، مما يوفر صلة بين عمليات موت الخلايا المبرمج والبيروبتوبوتيك. وقد وجدت الدراسات أن موت الخلايا المبرمج caspase-8 أمر بالغ الأهمية أيضا لتنظيم شكل آخر من أشكال PCD يسمى necroptosis. يؤدي فقدان caspase-8 إلى تنشيط السودوكيناز المختلط الشبيه بمجال كيناز السلالة المختلطة (MLKL) بوساطة مستقبلات سيرين ثريونين 3 (RIPK3) لقيادة مسار III-PCD للنخر27،28،29،30،31،32،33،34،35.

في حين تم تصنيف الكاسباس تاريخيا على أنه “غير أبوبتويتي” أو “التهابي” بناء على نوع موت الخلايا الذي يبدأه ، تشير الأدلة المتزايدة إلى وجود تداخل مكثف بين مسارات PCD المناعية الفطرية من خلال caspases 3,4. على سبيل المثال ، يشق caspase-1 الالتهابي من الالتهابات caspase-7 المبرمج في موقع التنشيط الكنسي34. يمكن أن يؤدي تنشيط Caspase-1 أيضا إلى انقسام ركائز موت الخلايا المبرمج مثل بوليميراز بوليميراز 1 (ADP-ribose) 1 (PARP1) 36. في الخلايا التي تفتقر إلى GSDMD ، يمكن أن يشق caspase-1 أيضا caspase-337,38. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ل caspase-3 المبرمج قانونا أن يشق gasdermin E (GSDME) للحث على PCD17,18 ويعالج أيضا GSDMD في شكل غير نشط40. علاوة على ذلك ، لوحظ تجنيد caspase-8 في المجمع الالتهابي 39،40،41،42،43،44،45 ، و caspase-8 هو منظم رئيسي للتنشيط الالتهابي الكنسي وغير الكنسي 39. هناك أيضا أدوار متداخلة وزائدة عن الحاجة ل caspase-8 و caspase-1 في العديد من الحالات الالتهابية ، ويحدث PCD المناعي الفطري الذي يتميز بتنشيط المكونات النارية واللافتوتيكية والميتة عبر طيف المرض39،46،47،48،49،50.

بناء على هذا الحديث المتبادل بين الكاسباس الالتهابي وموت الخلايا المبرمج ، تم تحديد فجوة رئيسية في الفهم الميكانيكي للمناعة الفطرية و PCD ، مما أدى إلى اكتشاف PANoptosis. PANoptosis هو شكل فريد من أشكال III-PCD يتم تنشيطه استجابة لمسببات الأمراض ، PAMPs ، DAMPs ، والتغيرات في التوازن ويتم تنظيمه بواسطة PANoptosomes – مجمعات جزيئية متعددة الأوجه تدمج مكونات من مسارات موت الخلايا الأخرى 44،50،51،52،53،54،55 . لا يمكن حساب مجمل التأثيرات البيولوجية في PANoptosis بشكل فردي عن طريق pyroptosis أو موت الخلايا المبرمج أو necroptosis وحده 3،4،35،36،39،46،47،48 ، حيث يتميز PANoptosis بتنشيط caspases متعددة ، بما في ذلك caspase-1 و caspase-11 و caspase-8 و caspase-9 و caspase-3 و / أو caspase-7 ، اعتمادا على السياق 44،48،49،50،51،52،53،54،56،57،58،59،60،61،62 . لقد تورط PANoptosis بشكل متزايد في الأمراض المعدية والالتهابية ، وكذلك في السرطانات وعلاجات السرطان3،4،35،36،39،44،46،47،48،49،50،51،52،53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

نظرا للدور الأساسي للكاسباز عبر مسارات موت الخلايا ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، وداء البروبتوسيس ، والتنخر ، و PANoptosis ، من المهم تطوير تقنيات لتوصيف تنشيطها وفهم التعقيد الكامل لمسارات PCD. يوضح البروتوكول هنا طريقة لتحفيز الخلايا وقياس التنشيط اللاحق للكاسباز (الشكل 1). تستفيد هذه الطريقة من الانقسام المحلل للبروتين للكاسباس ، وهو أمر مطلوب بشكل عام لتنشيطها ، كوسيلة لدراستها. من خلال النشاف الغربي ، يمكن تحديد أحجام البروتين ، مما يسمح بالتصور الواضح والتمايز بين pro-caspases غير النشطة وأشكالها المشقوقة المنشطة.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول في 1) قدرته على تقييم تنشيط كاسباس متعددة بالتوازي من مجموعة واحدة من الخلايا الداخلية لتحديد تنشيط PCD بشكل أكثر دقة و 2) استخدام تقنيات معملية بسيطة نسبيا لا تتطلب تدريبا مكثفا أو معدات باهظة الثمن. استخدمت البروتوكولات السابقة النشاف الغربي ، أو مراسلي الفلورسنت ، أو تلطيخ الأجسام المضادة لمراقبة تنشيط الكاسباز في طافات الثقافة ، والخلايا والأنسجة المحللة ، والخلايا الكاملة عن طريق الفحص المجهري ، وفي الجسم الحي67،68،69،70،71 ، ولكن هذه التقنيات بشكل عام تراقب فقط واحد أو اثنين من caspases في العينة. علاوة على ذلك ، في حين تم استخدام ركائز الببتيد الاصطناعية التي تحتوي على مواقع انشقاق الكاسباز التي تتألق عند الانقسام لمراقبة تنشيط الكاسباز في الخلية أو الأنسجة المحللة69 ، يمكن في كثير من الأحيان شق هذه الركائز بأكثر من كاسباز واحد ، مما يجعل من الصعب تحديد التنشيط المحدد للكاسباز الفردي في هذا النظام. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام النشاف الغربي بدلا من استخدام مراسلي الفلورسنت أو الطرق الأخرى القائمة على العلامات يسمح للباحثين باستخدام الخلايا الداخلية بدلا من إنشاء خطوط خلايا محددة مع جينات المراسل. هناك مزايا متعددة لاستخدام الخلايا الداخلية ، بما في ذلك حقيقة أن العديد من خطوط الخلايا الخالدة تعاني من نقص في جزيئات موت الخلايا الرئيسية72,73 ، مما قد يؤثر على النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح استخدام الخلايا الداخلية بتقييم أنواع الخلايا المتنوعة ، مثل الضامة والخلايا الظهارية والخلايا البطانية ، بدلا من سلالة واحدة. النشاف الغربي هو أيضا تقنية بسيطة نسبيا وفعالة من حيث التكلفة يمكن تنفيذها في المختبرات في جميع أنحاء العالم دون الحاجة إلى معدات كبيرة ومكلفة أو إعدادات معقدة.

هذا البروتوكول قابل للتطبيق على نطاق واسع عبر علم الأحياء لفهم كل من وظائف الكاسباس المعتمدة على موت الخلايا والمستقلة عن موت الخلايا ، بما في ذلك أدوارها ووظائفها في السقالات في مسارات الإشارات الالتهابية الأخرى74. يسمح تطبيق هذه الطريقة باتباع نهج موحد في دراسة مسارات PCD المناعية الفطرية والإشارات الالتهابية عبر الأمراض والظروف ، ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد العمليات التنظيمية الحرجة والروابط الميكانيكية التي ستفيد في تطوير الاستراتيجيات العلاجية المستقبلية.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام الحيوانات وإجراءاتها من قبل لجنة مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال حول استخدام الحيوانات ورعايتها. 1. إعداد الحلول قم بإعداد الوسائط المكيفة L929.اللوحة 1 × 106 خلايا L929 (انظر جدول المواد) في دورق زراعة الأنسجة 182 سم2 …

Representative Results

لوحظ PANoptosis استجابة للعديد من الالتهابات البكتيرية والفيروسية والفطرية والمحفزات الالتهابية الأخرى ، وكذلك في الخلايا السرطانية 44،48،49،50،51،52،53،54،56،57،58،60،<…

Discussion

توفر مراقبة انقسام الكاسباز وتنشيطه واحدة من أكثر الصور شمولا لتنشيط PCD المناعي الفطري كجزء من الاستجابة المناعية الفطرية. يوضح البروتوكول الموصوف هنا استراتيجية لمراقبة تنشيط الكاسباز استجابة لعدوى IAV و HSV1 و F. novicida والزناد المعقم LPS + ATP ، ولكن العديد من المحفزات الأخرى يمكن أن تحفز PC…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبر Kanneganti على تعليقاتهم واقتراحاتهم ، ونشكر J. Gullett ، دكتوراه ، على دعم التحرير العلمي. يتم دعم العمل في مختبرنا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) AI101935 و AI124346 و AI160179 و AR056296 و CA253095 (إلى T.-D.K.) والجمعيات الخيرية الأمريكية اللبنانية السورية (إلى T.-D.K.). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171 (1996).
  2. Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21 (2016).
  3. Gullett, J. M., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. It’s all in the PAN: Crosstalk, plasticity, redundancies, switches, and interconnectedness encompassed by PANoptosis underlying the totality of cell death-associated biological effects. Cells. 11 (9), 1495 (2022).
  4. Pandian, N., Kanneganti, T. D. PANoptosis: A unique innate immune inflammatory cell death modality. Journal of Immunology. 209 (9), 1625-1633 (2022).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Shi, Y. Caspase activation: Revisiting the induced proximity model. Cell. 117 (7), 855-858 (2004).
  7. Galluzzi, L., Lopez-Soto, A., Kumar, S., Kroemer, G. Caspases connect cell-death signaling to organismal homeostasis. Immunity. 44 (2), 221-231 (2016).
  8. Fernandes-Alnemri, T., Litwack, G., Alnemri, E. S. CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 30761-30764 (1994).
  9. Tewari, M., et al. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell. 81 (5), 801-809 (1995).
  10. Nicholson, D. W., et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature. 376 (6535), 37-43 (1995).
  11. Stennicke, H. R., et al. Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8. Journal of Biological Chemistry. 273 (42), 27084-27090 (1998).
  12. Twiddy, D., Cohen, G. M., Macfarlane, M., Cain, K. Caspase-7 is directly activated by the approximately 700-kDa apoptosome complex and is released as a stable XIAP-caspase-7 approximately 200-kDa complex. Journal of Biological Chemistry. 281 (7), 3876-3888 (2006).
  13. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Reviews of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  14. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
  15. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: Controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (3), 231-241 (2008).
  16. Morioka, S., Maueröder, C., Ravichandran, K. S. Living on the edge: Efferocytosis at the interface of homeostasis and pathology. Immunity. 50 (5), 1149-1162 (2019).
  17. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  18. Rogers, C., et al. Cleavage of DFNA5 by caspase-3 during apoptosis mediates progression to secondary necrotic/pyroptotic cell death. Nature Communications. 8, 14128 (2017).
  19. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  20. Shi, J., Gao, W., Shao, F. Pyroptosis: Gasdermin-mediated programmed necrotic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 245-254 (2017).
  21. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  22. Aglietti, R. A., et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7858-7863 (2016).
  23. Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341 (6151), 1250-1253 (2013).
  24. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  25. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  26. Lamkanfi, M., et al. Targeted peptidecentric proteomics reveals caspase-7 as a substrate of the caspase-1 inflammasomes. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (12), 2350-2363 (2008).
  27. Kalai, M., et al. Tipping the balance between necrosis and apoptosis in human and murine cells treated with interferon and dsRNA. Cell Death & Differentiation. 9 (9), 981-994 (2002).
  28. Li, C., et al. Development of atopic dermatitis-like skin disease from the chronic loss of epidermal caspase-8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22249-22254 (2010).
  29. Kovalenko, A., et al. Caspase-8 deficiency in epidermal keratinocytes triggers an inflammatory skin disease. Journal of Experimental Medicine. 206 (10), 2161-2177 (2009).
  30. Kang, T. B., et al. Caspase-8 serves both apoptotic and nonapoptotic roles. Journal of Immunology. 173 (5), 2976-2984 (2004).
  31. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  32. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  33. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  34. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  35. Hitomi, J., et al. Identification of a molecular signaling network that regulates a cellular necrotic cell death pathway. Cell. 135 (7), 1311-1323 (2008).
  36. Malireddi, R. K., Ippagunta, S., Lamkanfi, M., Kanneganti, T. D. Cutting edge: Proteolytic inactivation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 by the Nlrp3 and Nlrc4 inflammasomes. Journal of Immunology. 185 (6), 3127-3130 (2010).
  37. Tsuchiya, K., et al. Caspase-1 initiates apoptosis in the absence of gasdermin D. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  38. Taabazuing, C. Y., Okondo, M. C., Bachovchin, D. A. Pyroptosis and apoptosis pathways engage in bidirectional crosstalk in monocytes and macrophages. Cell Chemical Biology. 24 (4), 507-514 (2017).
  39. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. Journal of Immunology. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  40. Man, S. M., et al. Inflammasome activation causes dual recruitment of NLRC4 and NLRP3 to the same macromolecular complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7403-7408 (2014).
  41. Man, S. M., et al. Salmonella infection induces recruitment of Caspase-8 to the inflammasome to modulate IL-1beta production. Journal of Immunology. 191 (10), 5239-5246 (2013).
  42. Van Opdenbosch, N., et al. Caspase-1 engagement and TLR-induced c-FLIP expression suppress ASC/caspase-8-dependent apoptosis by inflammasome sensors NLRP1b and NLRC4. Cell Reports. 21 (12), 3427-3444 (2017).
  43. Pierini, R., et al. AIM2/ASC triggers caspase-8-dependent apoptosis in Francisella-infected caspase-1-deficient macrophages. Cell Death & Differentiation. 19 (10), 1709-1721 (2012).
  44. Lee, S., et al. AIM2 forms a complex with pyrin and ZBP1 to drive PANoptosis and host defence. Nature. 597 (7876), 415-419 (2021).
  45. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death & Differentiation. 20 (9), 1149-1160 (2013).
  46. Lukens, J. R., et al. Dietary modulation of the microbiome affects autoinflammatory disease. Nature. 516 (7530), 246-249 (2014).
  47. Gurung, P., Burton, A., Kanneganti, T. D. NLRP3 inflammasome plays a redundant role with caspase 8 to promote IL-1beta-mediated osteomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4452-4457 (2016).
  48. Kuriakose, T., et al. ZBP1/DAI is an innate sensor of influenza virus triggering the NLRP3 inflammasome and programmed cell death pathways. Science Immunology. 1 (2), (2016).
  49. Malireddi, R. K. S., et al. TAK1 restricts spontaneous NLRP3 activation and cell death to control myeloid proliferation. Journal of Experimental Medicine. 215 (4), 1023-1034 (2018).
  50. Malireddi, R. K. S., et al. Innate immune priming in the absence of TAK1 drives RIPK1 kinase activity-independent pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and inflammatory disease. Journal of Experimental Medicine. 217 (3), (2020).
  51. Christgen, S., et al. Identification of the PANoptosome: A molecular platform triggering pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 237 (2020).
  52. Malireddi, R. K. S., et al. RIPK1 distinctly regulates Yersinia-induced inflammatory cell death, PANoptosis. Immunohorizons. 4 (12), 789-796 (2020).
  53. Zheng, M., Karki, R., Vogel, P., Kanneganti, T. D. Caspase-6 is a key regulator of innate immunity, inflammasome activation, and host defense. Cell. 181 (3), 674-687 (2020).
  54. Karki, R., et al. ADAR1 restricts ZBP1-mediated immune response and PANoptosis to promote tumorigenesis. Cell Reports. 37 (3), 109858 (2021).
  55. Wang, Y., et al. Single cell analysis of PANoptosome cell death complexes through an expansion microscopy method. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (10), 531 (2022).
  56. Malireddi, R. K. S., et al. Inflammatory cell death, PANoptosis, mediated by cytokines in diverse cancer lineages inhibits tumor growth. Immunohorizons. 5 (7), 568-580 (2021).
  57. Kesavardhana, S., et al. The Zα2 domain of ZBP1 is a molecular switch regulating influenza-induced PANoptosis and perinatal lethality during development. Journal of Biological Chemistry. 295 (24), 8325-8330 (2020).
  58. Banoth, B., et al. ZBP1 promotes fungi-induced inflammasome activation and pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 18276-18283 (2020).
  59. Karki, R., et al. Interferon regulatory factor 1 regulates PANoptosis to prevent colorectal cancer. JCI Insight. 5 (12), 136720 (2020).
  60. Zheng, M., et al. Impaired NLRP3 inflammasome activation/pyroptosis leads to robust inflammatory cell death via caspase-8/RIPK3 during coronavirus infection. Journal of Biological Chemistry. 295 (41), 14040-14052 (2020).
  61. Karki, R., et al. Synergism of TNF-α and IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168 (2021).
  62. Karki, R., et al. ZBP1-dependent inflammatory cell death, PANoptosis, and cytokine storm disrupt IFN therapeutic efficacy during coronavirus infection. Science Immunology. 7 (74), (2022).
  63. Jiang, W., Deng, Z., Dai, X., Zhao, W. PANoptosis: A new insight into oral infectious diseases. Frontiers in Immunology. 12, 789610 (2021).
  64. Chi, D., et al. Real-time induction of macrophage apoptosis, pyroptosis, and necroptosis by Enterococcus faecalis OG1RF and two root canal isolated strains. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 720147 (2021).
  65. Lin, J. F., et al. Phosphorylated NFS1 weakens oxaliplatin-based chemosensitivity of colorectal cancer by preventing PANoptosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 54 (2022).
  66. Song, M., et al. Self-assembled polymeric nanocarrier-mediated co-delivery of metformin and doxorubicin for melanoma therapy. Drug Delivery. 28 (1), 594-606 (2021).
  67. Boucher, D., Chan, A., Ross, C., Schroder, K. Quantifying caspase-1 activity in murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 1725, 163-176 (2018).
  68. Boucher, D., Duclos, C., Denault, J. B. General in vitro caspase assay procedures. Methods in Molecular Biology. 1133, 3-39 (2014).
  69. Kaushal, V., Herzog, C., Haun, R. S., Kaushal, G. P. Caspase protocols in mice. Methods in Molecular Biology. 1133, 141-154 (2014).
  70. Swacha, P., Gekara, N. O., Erttmann, S. F. Biochemical and microscopic analysis of inflammasome complex formation. Methods in Enzymology. 625, 287-298 (2019).
  71. Talley, S., et al. A caspase-1 biosensor to monitor the progression of inflammation in vivo. Journal of Immunology. 203 (9), 2497-2507 (2019).
  72. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 receptor differentially couples to distinct release pathways for IL-1beta in mouse macrophage. Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  73. Yu, J. W., et al. Cryopyrin and pyrin activate caspase-1, but not NF-kappaB, via ASC oligomerization. Cell Death & Differentiation. 13 (2), 236-249 (2006).
  74. Henry, C. M., Martin, S. J. Caspase-8 acts in a non-enzymatic role as a scaffold for assembly of a pro-inflammatory "FADDosome" complex upon TRAIL stimulation. Molecular Cell. 65 (4), 715-729 (2017).
  75. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  76. Simpson, R. J. Homogenization of mammalian tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).

Tags

Caspase ActivationInnate Immune Cell DeathDisease MechanismsTherapeutic StrategiesCell Death ProcessesBone Marrow-derived Macrophages (BMDMs)Influenza A VirusProtein CollectionSDS-PAGECaspase Lysis Buffer
check_url/64308?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Han, J., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image