JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Evaluering af caspaseaktivering for at vurdere medfødt immuncelledød

Published: January 20, 2023
doi:
10.3791/64308
, ,
1Department of Immunology,St. Jude Children’s Research Hospital

Summary

Denne protokol beskriver en omfattende metode til vurdering af caspaseaktivering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 og caspase-11) som reaktion på både in vitro og in vivo (hos mus) modeller for infektion, sterile fornærmelser og kræft for at bestemme initieringen af celledødsveje, såsom pyroptose, apoptose, nekrotose og PANoptose.

Abstract

Medfødt immunitet giver den kritiske første forsvarslinje som reaktion på patogener og sterile fornærmelser. En vigtig mekanistisk komponent i dette respons er initieringen af medfødt immunprogrammeret celledød (PCD) for at eliminere inficerede eller beskadigede celler og udbrede immunresponser. Imidlertid er overskydende PCD forbundet med betændelse og patologi. Derfor er forståelse af aktivering og regulering af PCD et centralt aspekt ved karakterisering af medfødte immunresponser og identifikation af nye terapeutiske mål på tværs af sygdomsspektret.

Denne protokol tilvejebringer metoder til karakterisering af medfødt immun-PCD-aktivering ved overvågning af caspaser, en familie af cysteinafhængige proteaser, der ofte er forbundet med forskellige PCD-veje, herunder apoptose, pyroptose, nekrotose og PANoptose. Indledende rapporter karakteriserede caspase-2, caspase-8, caspase-9 og caspase-10 som initiator-caspaser og caspase-3, caspase-6 og caspase-7 som effektor-caspaser i apoptose, mens senere undersøgelser fandt de inflammatoriske caspaser, caspase-1, caspase-4, caspase-5 og caspase-11, drev pyroptose. Det er nu kendt, at der er omfattende krydstale mellem caspaserne og andre medfødte immun- og celledødsmolekyler på tværs af de tidligere definerede PCD-veje, hvilket identificerer et centralt videnshul i den mekanistiske forståelse af medfødt immunitet og PCD og fører til karakterisering af PANoptosis. PANoptose er en unik medfødt immuninflammatorisk PCD-vej reguleret af PANoptosome-komplekser, som integrerer komponenter, herunder caspaser, fra andre celledødsveje.

Her tilvejebringes metoder til vurdering af aktiveringen af caspaser som reaktion på forskellige stimuli. Disse metoder muliggør karakterisering af PCD-veje både in vitro og in vivo, da aktiverede caspaser gennemgår proteolytisk spaltning, der kan visualiseres ved western blotting ved anvendelse af optimale antistoffer og blottingbetingelser. Der er etableret en protokol og western blotting-arbejdsgang, der muliggør vurdering af aktiveringen af flere caspaser fra den samme cellulære population, hvilket giver en omfattende karakterisering af PCD-processerne. Denne metode kan anvendes på tværs af forskningsområder inden for udvikling, homeostase, infektion, inflammation og kræft til at evaluere PCD-veje gennem cellulære processer inden for sundhed og sygdom.

Introduction

Det medfødte immunsystem fungerer som den første forsvarslinje under infektion og som reaktion på sterile stimuli, såsom vævsskade og ændringer i homeostase. Medfødte immunsensorer på celleoverfladen og i cytoplasmaet reagerer på patogen- eller skadeassocierede molekylære mønstre (henholdsvis PAMP’er eller DAMP’er) for at udløse inflammatoriske signalveje og cellulære reaktioner. En af nøgleprocesserne i det medfødte immunrespons er induktion af celledød for at fjerne inficerede eller beskadigede celler og drive yderligere medfødte og adaptive immunresponser. Programmeret celledød (PCD) er en meget bevaret proces på tværs af arter, der fremhæver dens evolutionære betydning som en medfødt immunmekanisme.

Der er flere medfødte immun-PCD-veje, der kan aktiveres i alle celletyper. Caspaser er en nøglefamilie af stærkt konserverede, intracellulære, cysteinafhængige proteaser, der er kritiske på tværs af mange PCD-veje, herunder den traditionelt ikke-inflammatoriske apoptosevej samt inflammatoriske PCD-veje såsom pyroptose, nekrotose og PANoptosis 1,2,3,4,5 . Der er 11 humane og 10 murine caspaser, der er veldefinerede, samt pseudo-caspaser, der kan være funktionelle, og de fleste udtrykkes konstitutivt som inaktive monomere eller dimeriske pro-caspaser, der kræver spaltning til aktivering 6,7. Kaspaser indeholder også vigtige domæner til rekruttering og dannelse af multiproteinkomplekser. Disse omfatter caspase aktivering og rekruttering domæne (CARD), som kan findes i caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 og caspase-11, eller død effektor domæne (DED), som findes i caspase-8 og caspase-10. Gennem både deres proteolytiske aktivitet og deres evne til at danne multiproteinkomplekser er caspaser kritiske drivkræfter for medfødt immun-PCD.

Caspasernes rolle i medfødt immun-PCD blev først identificeret i apoptose, hvor initiatorcaspaserne, caspase-2, caspase-8, caspase-9 og caspase-10, aktiverer bødlekaspaserne, caspase-3, caspase-6 og caspase-7, for at drive celledød 8,9,10,11,12. Initiator-caspaser kan aktiveres af forskellige signalkaskader; Den ydre vej aktiverer caspase-8 gennem ekstracellulær ligand-induceret dødsreceptorsignalering, og den indre vej aktiverer caspase-9 gennem forstyrrelse af mitokondrieintegritet13. Aktiverede initiatorcaspaser spalter linkeren, der adskiller de store og små katalytiske underenheder af bødlekaser for at producere deres aktive former. Bødlekaserne spalter derefter deres substrater for at adskille cellen, hvilket resulterer i DNA-nedbrydning, membranblæsning, nuklear fragmentering og frigivelse af apoptotiske legemer14,15. Denne proces ender typisk i en ikke-lytisk og ikke-inflammatorisk form for celledød, når den kombineres med den øjeblikkelige clearance af de døende celler ved efferocytose16. Imidlertid kan defekter i efferocytose eller mangel på fagocytiske celler føre til akkumulering af apoptotiske celler, som derefter gennemgår lytisk og inflammatorisk celledød17,18.

De inflammatoriske caspaser, herunder caspase-1 (menneske og mus), caspase-4 og caspase-5 (menneske) og caspase-11 (mus), har vist sig at blive aktiveret under en form for inflammatorisk medfødt immun-PCD (III-PCD) kaldet pyroptose. Caspase-1-aktivering er forbundet med dannelsen af inflammasomer, som er multiproteinkomplekser indeholdende en cytosolisk medfødt immunsensor, et adaptormolekyle (apoptoseassocieret specklignende protein indeholdende et CARD [ASC]) og caspase-1. Dannelsen af dette kompleks tillader caspase-1 at gennemgå nærhedsmedieret autoproteolyse for at frigive sin aktive form, som kan spalte målsubstrater, herunder de proinflammatoriske cytokiner interleukin (IL)-1β og IL-18 og det poredannende molekyle gasdermin D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspase-11, caspase-4 og caspase-5 kan også aktivere GSDMD uden opstrøms dannelse af inflammasomet efter detektering af PAMP’er såsom lipopolysaccharid (LPS)19,20. Disse caspaser gennemgår dimerisering efterfulgt af oligomerisering og selvspaltning til aktivering ved binding til cytosolisk LPS, hvilket fører til ikke-kanonisk inflammasomaktivering 24,25,26 og caspase-1-aktivering på en celle-iboende måde for at inducere IL-1β og IL-18 modning 20. Modningen og frigivelsen af disse proinflammatoriske cytokiner karakteriserer disse caspaser som “inflammatoriske”. Derudover har den apoptotiske caspase-8 vist sig at lokalisere til inflammasomet, hvilket giver en forbindelse mellem apoptotiske og pyroptotiske processer. Undersøgelser har vist, at den apoptotiske caspase-8 også er kritisk for regulering af en anden form for PCD kaldet necroptosis. Tabet af caspase-8 resulterer i spontan receptor-interagerende serin-threonin kinase 3 (RIPK3)-medieret blandet afstamning kinase domæne-lignende pseudokinase (MLKL) aktivering for at drive III-PCD vejen for necroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

Mens caspaser historisk er blevet klassificeret som “apoptotisk” eller “inflammatorisk” baseret på den type celledød, de initierer, tyder voksende beviser på, at der er omfattende krydstale mellem de medfødte immun-PCD-veje gennem caspaser 3,4. For eksempel spalter den inflammatoriske caspase-1 fra inflammasomer den apoptotiske caspase-7 på sit kanoniske aktiveringssted34. Caspase-1-aktivering kan også føre til spaltning af apoptotiske substrater, såsom poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1)36. I celler, der mangler GSDMD, kan caspase-1 også spalte caspase-337,38. Derudover kan den kanonisk apoptotiske caspase-3 spalte gasdermin E (GSDME) for at inducere PCD17,18 og behandler også GSDMD i en inaktiv form40. Desuden er caspase-8 rekruttering til inflammasomkomplekset blevet observeret 39,40,41,42,43,44,45, og caspase-8 er en nøgleregulator for kanonisk og ikke-kanonisk inflammasomaktivering 39. Der er også overlappende og overflødige roller for caspase-8 og caspase-1 i mange inflammatoriske tilstande, og medfødt immun-PCD karakteriseret ved aktivering af pyroptotiske, apoptotiske og necroptotiske komponenter forekommer på tværs af sygdomsspektret 39,46,47,48,49,50.

Baseret på denne krydstale mellem inflammatoriske og apoptotiske caspaser blev der identificeret et centralt hul i den mekanistiske forståelse af medfødt immunitet og PCD, hvilket førte til opdagelsen af PANoptose. PANoptose er en unik form for III-PCD, der aktiveres som reaktion på patogener, PAMP’er, DAMP’er og ændringer i homeostase og reguleres af PANoptosomer – mangefacetterede makromolekylære komplekser, der integrerer komponenter fra andre celledødsveje 44,50,51,52,53,54,55 . Totaliteten af de biologiske virkninger i PANoptose kan ikke individuelt redegøres for ved pyroptose, apoptose eller necroptose alene 3,4,35,36,39,46,47,48, da PANoptose er karakteriseret ved aktivering af flere caspaser, herunder caspase-1, caspase-11, caspase-8, caspase-9, caspase-3 og / eller caspase-7, Afhængigt af konteksten 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptose er i stigende grad blevet impliceret i infektiøse og inflammatoriske sygdomme samt i kræft og kræftbehandlinger 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

I betragtning af den væsentlige rolle, som caspaser spiller på tværs af celledødsveje, herunder i apoptose, pyroptose, nekrotose og PANoptose, er det vigtigt at udvikle teknikker til at karakterisere deres aktivering og forstå den fulde kompleksitet af PCD-veje. Protokollen her beskriver en metode til at stimulere celler og måle den efterfølgende aktivering af caspaser (figur 1). Denne metode udnytter den proteolytiske spaltning af caspaser, som generelt er nødvendig for deres aktivering, som et middel til at studere dem. Gennem western blotting kan proteinstørrelserne bestemmes, hvilket muliggør klar visualisering og differentiering af inaktive pro-caspaser og deres aktiverede, spaltede former.

De største fordele ved denne protokol er 1) dens evne til at vurdere aktiveringen af flere caspaser parallelt fra en enkelt population af endogene celler for mere præcist at bestemme PCD-aktivering og 2) brugen af relativt enkle laboratorieteknikker, der ikke kræver omfattende træning eller dyrt udstyr. Tidligere protokoller har brugt western blotting, fluorescerende reportere eller antistoffarvning til at overvåge caspaseaktivering i kultursupernatanter, celle- og vævslysater, hele celler via mikroskopi og in vivo 67,68,69,70,71, men disse teknikker overvåger generelt kun en eller to caspaser i en prøve. Mens syntetiske peptidsubstrater indeholdende caspase spaltningssteder, der fluorescerer ved spaltning, er blevet brugt til at overvåge caspaseaktivering i celle- eller vævslysater69, kan disse substrater ofte spaltes af mere end en caspase, hvilket gør det vanskeligt at bestemme den specifikke aktivering af individuelle caspaser i dette system. Derudover giver brugen af western blotting snarere end brugen af fluorescerende reportere eller andre tagbaserede metoder forskere mulighed for at bruge endogene celler i stedet for at skabe specifikke cellelinjer med reportergener. Der er flere fordele ved at bruge endogene celler, herunder det faktum, at mange udødeliggjorte cellelinjer manglernøglecelledødsmolekyler 72,73, hvilket kan påvirke resultaterne. Derudover giver brug af endogene celler mulighed for evaluering af forskellige celletyper, såsom makrofager, epitelceller og endotelceller, snarere end en enkelt afstamning. Western blotting er også en relativt enkel og omkostningseffektiv teknik, der kan udføres i laboratorier rundt om i verden uden behov for stort, dyrt udstyr eller komplicerede opsætninger.

Denne protokol er bredt anvendelig på tværs af biologi til at forstå både celledødsafhængige og celledødsuafhængige funktioner hos caspaser, herunder deres stilladsroller og funktioner i andre inflammatoriske signalveje74. Anvendelse af denne metode giver mulighed for en samlet tilgang i undersøgelsen af medfødte immun-PCD-veje og inflammatorisk signalering på tværs af sygdomme og tilstande, og denne protokol kan bruges til at identificere kritiske reguleringsprocesser og mekanistiske forbindelser, der vil informere udviklingen af fremtidige terapeutiske strategier.

Protocol

Dyrenes brug og procedurer blev godkendt af St. Jude Children’s Research Hospital Committee on the Use and Care of Animals. 1. Forberedelse af løsningerne Forbered medier med L929-kondition.Plade 1 × 106 L929-celler (se materialetabel) i en 182 cm2 vævskulturkolbe indeholdende 50 ml L929-dyrkningsmedier (se tabel 1 vedrørende fremstilling af medier). Cellerne dyrkes i en befugtet inkubator…

Representative Results

PANoptose er blevet observeret som reaktion på talrige bakterielle, virale og svampeinfektioner og andre inflammatoriske stimuli såvel som i kræftceller 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 …

Discussion

Overvågning af caspase spaltning og aktivering giver et af de mest omfattende billeder af medfødt immun PCD-aktivering som en del af det medfødte immunrespons. Protokollen beskrevet her demonstrerer en strategi til overvågning af caspaseaktivering som reaktion på IAV-, HSV1- og F. novicida-infektioner og den sterile udløser LPS + ATP, men mange andre stimuli kan inducere PCD og kan bruges i denne metode, som det er vist i flere publikationer 44,48,49,50,51,52,53,54,56<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker medlemmer af Kanneganti-laboratoriet for deres kommentarer og forslag, og vi takker J. Gullett, ph.d., for videnskabelig redigeringsstøtte. Arbejdet i vores laboratorium støttes af National Institutes of Health (NIH) tilskud AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 og CA253095 (til T.-D.K.) og af de amerikanske libanesiske syriske associerede velgørenhedsorganisationer (til T.-D.K.). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.

Materials

0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171 (1996).
  2. Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21 (2016).
  3. Gullett, J. M., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. It’s all in the PAN: Crosstalk, plasticity, redundancies, switches, and interconnectedness encompassed by PANoptosis underlying the totality of cell death-associated biological effects. Cells. 11 (9), 1495 (2022).
  4. Pandian, N., Kanneganti, T. D. PANoptosis: A unique innate immune inflammatory cell death modality. Journal of Immunology. 209 (9), 1625-1633 (2022).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Shi, Y. Caspase activation: Revisiting the induced proximity model. Cell. 117 (7), 855-858 (2004).
  7. Galluzzi, L., Lopez-Soto, A., Kumar, S., Kroemer, G. Caspases connect cell-death signaling to organismal homeostasis. Immunity. 44 (2), 221-231 (2016).
  8. Fernandes-Alnemri, T., Litwack, G., Alnemri, E. S. CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 30761-30764 (1994).
  9. Tewari, M., et al. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell. 81 (5), 801-809 (1995).
  10. Nicholson, D. W., et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature. 376 (6535), 37-43 (1995).
  11. Stennicke, H. R., et al. Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8. Journal of Biological Chemistry. 273 (42), 27084-27090 (1998).
  12. Twiddy, D., Cohen, G. M., Macfarlane, M., Cain, K. Caspase-7 is directly activated by the approximately 700-kDa apoptosome complex and is released as a stable XIAP-caspase-7 approximately 200-kDa complex. Journal of Biological Chemistry. 281 (7), 3876-3888 (2006).
  13. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Reviews of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  14. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
  15. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: Controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (3), 231-241 (2008).
  16. Morioka, S., Maueröder, C., Ravichandran, K. S. Living on the edge: Efferocytosis at the interface of homeostasis and pathology. Immunity. 50 (5), 1149-1162 (2019).
  17. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  18. Rogers, C., et al. Cleavage of DFNA5 by caspase-3 during apoptosis mediates progression to secondary necrotic/pyroptotic cell death. Nature Communications. 8, 14128 (2017).
  19. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  20. Shi, J., Gao, W., Shao, F. Pyroptosis: Gasdermin-mediated programmed necrotic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 245-254 (2017).
  21. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  22. Aglietti, R. A., et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7858-7863 (2016).
  23. Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341 (6151), 1250-1253 (2013).
  24. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  25. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  26. Lamkanfi, M., et al. Targeted peptidecentric proteomics reveals caspase-7 as a substrate of the caspase-1 inflammasomes. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (12), 2350-2363 (2008).
  27. Kalai, M., et al. Tipping the balance between necrosis and apoptosis in human and murine cells treated with interferon and dsRNA. Cell Death & Differentiation. 9 (9), 981-994 (2002).
  28. Li, C., et al. Development of atopic dermatitis-like skin disease from the chronic loss of epidermal caspase-8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22249-22254 (2010).
  29. Kovalenko, A., et al. Caspase-8 deficiency in epidermal keratinocytes triggers an inflammatory skin disease. Journal of Experimental Medicine. 206 (10), 2161-2177 (2009).
  30. Kang, T. B., et al. Caspase-8 serves both apoptotic and nonapoptotic roles. Journal of Immunology. 173 (5), 2976-2984 (2004).
  31. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  32. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  33. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  34. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  35. Hitomi, J., et al. Identification of a molecular signaling network that regulates a cellular necrotic cell death pathway. Cell. 135 (7), 1311-1323 (2008).
  36. Malireddi, R. K., Ippagunta, S., Lamkanfi, M., Kanneganti, T. D. Cutting edge: Proteolytic inactivation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 by the Nlrp3 and Nlrc4 inflammasomes. Journal of Immunology. 185 (6), 3127-3130 (2010).
  37. Tsuchiya, K., et al. Caspase-1 initiates apoptosis in the absence of gasdermin D. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  38. Taabazuing, C. Y., Okondo, M. C., Bachovchin, D. A. Pyroptosis and apoptosis pathways engage in bidirectional crosstalk in monocytes and macrophages. Cell Chemical Biology. 24 (4), 507-514 (2017).
  39. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. Journal of Immunology. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  40. Man, S. M., et al. Inflammasome activation causes dual recruitment of NLRC4 and NLRP3 to the same macromolecular complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7403-7408 (2014).
  41. Man, S. M., et al. Salmonella infection induces recruitment of Caspase-8 to the inflammasome to modulate IL-1beta production. Journal of Immunology. 191 (10), 5239-5246 (2013).
  42. Van Opdenbosch, N., et al. Caspase-1 engagement and TLR-induced c-FLIP expression suppress ASC/caspase-8-dependent apoptosis by inflammasome sensors NLRP1b and NLRC4. Cell Reports. 21 (12), 3427-3444 (2017).
  43. Pierini, R., et al. AIM2/ASC triggers caspase-8-dependent apoptosis in Francisella-infected caspase-1-deficient macrophages. Cell Death & Differentiation. 19 (10), 1709-1721 (2012).
  44. Lee, S., et al. AIM2 forms a complex with pyrin and ZBP1 to drive PANoptosis and host defence. Nature. 597 (7876), 415-419 (2021).
  45. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death & Differentiation. 20 (9), 1149-1160 (2013).
  46. Lukens, J. R., et al. Dietary modulation of the microbiome affects autoinflammatory disease. Nature. 516 (7530), 246-249 (2014).
  47. Gurung, P., Burton, A., Kanneganti, T. D. NLRP3 inflammasome plays a redundant role with caspase 8 to promote IL-1beta-mediated osteomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4452-4457 (2016).
  48. Kuriakose, T., et al. ZBP1/DAI is an innate sensor of influenza virus triggering the NLRP3 inflammasome and programmed cell death pathways. Science Immunology. 1 (2), (2016).
  49. Malireddi, R. K. S., et al. TAK1 restricts spontaneous NLRP3 activation and cell death to control myeloid proliferation. Journal of Experimental Medicine. 215 (4), 1023-1034 (2018).
  50. Malireddi, R. K. S., et al. Innate immune priming in the absence of TAK1 drives RIPK1 kinase activity-independent pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and inflammatory disease. Journal of Experimental Medicine. 217 (3), (2020).
  51. Christgen, S., et al. Identification of the PANoptosome: A molecular platform triggering pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 237 (2020).
  52. Malireddi, R. K. S., et al. RIPK1 distinctly regulates Yersinia-induced inflammatory cell death, PANoptosis. Immunohorizons. 4 (12), 789-796 (2020).
  53. Zheng, M., Karki, R., Vogel, P., Kanneganti, T. D. Caspase-6 is a key regulator of innate immunity, inflammasome activation, and host defense. Cell. 181 (3), 674-687 (2020).
  54. Karki, R., et al. ADAR1 restricts ZBP1-mediated immune response and PANoptosis to promote tumorigenesis. Cell Reports. 37 (3), 109858 (2021).
  55. Wang, Y., et al. Single cell analysis of PANoptosome cell death complexes through an expansion microscopy method. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (10), 531 (2022).
  56. Malireddi, R. K. S., et al. Inflammatory cell death, PANoptosis, mediated by cytokines in diverse cancer lineages inhibits tumor growth. Immunohorizons. 5 (7), 568-580 (2021).
  57. Kesavardhana, S., et al. The Zα2 domain of ZBP1 is a molecular switch regulating influenza-induced PANoptosis and perinatal lethality during development. Journal of Biological Chemistry. 295 (24), 8325-8330 (2020).
  58. Banoth, B., et al. ZBP1 promotes fungi-induced inflammasome activation and pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 18276-18283 (2020).
  59. Karki, R., et al. Interferon regulatory factor 1 regulates PANoptosis to prevent colorectal cancer. JCI Insight. 5 (12), 136720 (2020).
  60. Zheng, M., et al. Impaired NLRP3 inflammasome activation/pyroptosis leads to robust inflammatory cell death via caspase-8/RIPK3 during coronavirus infection. Journal of Biological Chemistry. 295 (41), 14040-14052 (2020).
  61. Karki, R., et al. Synergism of TNF-α and IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168 (2021).
  62. Karki, R., et al. ZBP1-dependent inflammatory cell death, PANoptosis, and cytokine storm disrupt IFN therapeutic efficacy during coronavirus infection. Science Immunology. 7 (74), (2022).
  63. Jiang, W., Deng, Z., Dai, X., Zhao, W. PANoptosis: A new insight into oral infectious diseases. Frontiers in Immunology. 12, 789610 (2021).
  64. Chi, D., et al. Real-time induction of macrophage apoptosis, pyroptosis, and necroptosis by Enterococcus faecalis OG1RF and two root canal isolated strains. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 720147 (2021).
  65. Lin, J. F., et al. Phosphorylated NFS1 weakens oxaliplatin-based chemosensitivity of colorectal cancer by preventing PANoptosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 54 (2022).
  66. Song, M., et al. Self-assembled polymeric nanocarrier-mediated co-delivery of metformin and doxorubicin for melanoma therapy. Drug Delivery. 28 (1), 594-606 (2021).
  67. Boucher, D., Chan, A., Ross, C., Schroder, K. Quantifying caspase-1 activity in murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 1725, 163-176 (2018).
  68. Boucher, D., Duclos, C., Denault, J. B. General in vitro caspase assay procedures. Methods in Molecular Biology. 1133, 3-39 (2014).
  69. Kaushal, V., Herzog, C., Haun, R. S., Kaushal, G. P. Caspase protocols in mice. Methods in Molecular Biology. 1133, 141-154 (2014).
  70. Swacha, P., Gekara, N. O., Erttmann, S. F. Biochemical and microscopic analysis of inflammasome complex formation. Methods in Enzymology. 625, 287-298 (2019).
  71. Talley, S., et al. A caspase-1 biosensor to monitor the progression of inflammation in vivo. Journal of Immunology. 203 (9), 2497-2507 (2019).
  72. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 receptor differentially couples to distinct release pathways for IL-1beta in mouse macrophage. Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  73. Yu, J. W., et al. Cryopyrin and pyrin activate caspase-1, but not NF-kappaB, via ASC oligomerization. Cell Death & Differentiation. 13 (2), 236-249 (2006).
  74. Henry, C. M., Martin, S. J. Caspase-8 acts in a non-enzymatic role as a scaffold for assembly of a pro-inflammatory "FADDosome" complex upon TRAIL stimulation. Molecular Cell. 65 (4), 715-729 (2017).
  75. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  76. Simpson, R. J. Homogenization of mammalian tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).

Tags

Caspase ActivationInnate Immune Cell DeathDisease MechanismsTherapeutic StrategiesCell Death ProcessesBone Marrow-derived Macrophages (BMDMs)Influenza A VirusProtein CollectionSDS-PAGECaspase Lysis Buffer
check_url/64308?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Han, J., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image