Valutazione dell'attivazione della caspasi per valutare la morte delle cellule immunitarie innate
Summary
Questo protocollo descrive un metodo completo per valutare l’attivazione della caspasi (caspasi-1, caspasi-3, caspasi-7, caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-11) in risposta a modelli di infezione, insulti sterili e cancro sia in vitro che in vivo (nei topi) per determinare l’inizio delle vie di morte cellulare, come piroptosi, apoptosi, necroptosi e PANoptosi.
Abstract
L’immunità innata fornisce la prima linea di difesa critica in risposta agli agenti patogeni e agli insulti sterili. Una componente meccanicistica chiave di questa risposta è l’inizio della morte cellulare immunoprogrammata innata (PCD) per eliminare le cellule infette o danneggiate e propagare le risposte immunitarie. Tuttavia, l’eccesso di PCD è associato a infiammazione e patologia. Pertanto, la comprensione dell’attivazione e della regolazione della PCD è un aspetto centrale della caratterizzazione delle risposte immunitarie innate e dell’identificazione di nuovi bersagli terapeutici in tutto lo spettro della malattia.
Questo protocollo fornisce metodi per caratterizzare l’attivazione immunitaria innata della PCD monitorando le caspasi, una famiglia di proteasi dipendenti dalla cisteina che sono spesso associate a diversi percorsi di PCD, tra cui apoptosi, piroptosi, necroptosi e PANoptosi. I rapporti iniziali hanno caratterizzato la caspasi-2, la caspasi-8, la caspasi-9 e la caspasi-10 come caspasi iniziatrici e le caspasi-3, caspasi-6 e caspasi-7 come caspasi effettrici nell’apoptosi, mentre studi successivi hanno scoperto che le caspasi infiammatorie, caspasi-1, caspasi-4, caspasi-5 e caspasi-11, guidano la piroptosi. È ormai noto che esiste un’ampia diafonia tra le caspasi e altre molecole innate di morte immunitaria e cellulare attraverso i percorsi PCD precedentemente definiti, identificando una lacuna di conoscenza chiave nella comprensione meccanicistica dell’immunità innata e della PCD e portando alla caratterizzazione della PANoptosis. La PANoptosi è una via PCD infiammatoria immunitaria innata unica regolata da complessi PANoptosoma, che integrano componenti, comprese le caspasi, da altre vie di morte cellulare.
Qui vengono forniti metodi per valutare l’attivazione delle caspasi in risposta a vari stimoli. Questi metodi consentono la caratterizzazione delle vie della PCD sia in vitro che in vivo, poiché le caspasi attivate subiscono una scissione proteolitica che può essere visualizzata mediante western blotting utilizzando anticorpi e condizioni di blotting ottimali. Sono stati stabiliti un protocollo e un flusso di lavoro western blotting che consentono la valutazione dell’attivazione di più caspasi dalla stessa popolazione cellulare, fornendo una caratterizzazione completa dei processi PCD. Questo metodo può essere applicato in tutte le aree di ricerca in sviluppo, omeostasi, infezione, infiammazione e cancro per valutare i percorsi PCD attraverso i processi cellulari in salute e malattia.
Introduction
Il sistema immunitario innato agisce come prima linea di difesa durante l’infezione e in risposta a stimoli sterili, come lesioni tissutali e alterazioni dell’omeostasi. I sensori immunitari innati sulla superficie cellulare e nel citoplasma rispondono ai modelli molecolari associati a patogeni o danni (PAMP o DAMP, rispettivamente) per innescare vie di segnalazione infiammatoria e risposte cellulari. Uno dei processi chiave della risposta immunitaria innata è l’induzione della morte cellulare per rimuovere le cellule infette o danneggiate e guidare ulteriori risposte immunitarie innate e adattative. La morte cellulare programmata (PCD) è un processo altamente conservato tra le specie, evidenziando la sua importanza evolutiva come meccanismo immunitario innato.
Esistono diversi percorsi immunitari innati della PCD che possono essere attivati in tutti i tipi di cellule. Le caspasi sono una famiglia chiave di proteasi altamente conservate, intracellulari, dipendenti dalla cisteina che sono fondamentali in molte vie della PCD, compresa la via dell’apoptosi tradizionalmente non infiammatoria, così come le vie infiammatorie della PCD come la piroptosi, la necroptosi e la PANoptosi 1,2,3,4,5 . Ci sono 11 caspasi umane e 10 murine che sono ben definite, così come pseudo-caspasi che possono essere funzionali, e la maggior parte sono costitutivamente espresse come pro-caspasi monomeriche o dimeriche inattive che richiedono la scissione per l’attivazione 6,7. Le caspasi contengono anche importanti domini per il reclutamento e la formazione di complessi multiproteici. Questi includono il dominio di attivazione e reclutamento delle caspasi (CARD), che può essere trovato in caspasi-1, caspasi-2, caspasi-4, caspasi-5, caspasi-9 e caspasi-11, o il dominio effettore della morte (DED), che si trova in caspasi-8 e caspasi-10. Attraverso la loro attività proteolitica e la loro capacità di formare complessi multiproteici, le caspasi sono fattori critici della PCD immunitaria innata.
Il ruolo delle caspasi nella PCD immunitaria innata è stato identificato per la prima volta nell’apoptosi, dove le caspasi iniziatrici, caspasi-2, caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-10, attivano le caspasi del boia, caspasi-3, caspasi-6 e caspasi-7, per guidare la morte cellulare 8,9,10,11,12. Le caspasi iniziatrici possono essere attivate da diverse cascate di segnalazione; La via estrinseca attiva la caspasi-8 attraverso la segnalazione del recettore di morte indotta dal ligando extracellulare e la via intrinseca attiva la caspasi-9 attraverso l’interruzione dell’integrità mitocondriale13. Le caspasi iniziatrici attivate fendono il linker separando le subunità catalitiche grandi e piccole delle caspasi del boia per produrre le loro forme attive. Le caspasi del boia quindi fendono i loro substrati per disassemblare la cellula, con conseguente degradazione del DNA, blebbing della membrana, frammentazione nucleare e rilascio di corpi apoptotici14,15. Questo processo termina tipicamente in una forma non litica e non infiammatoria di morte cellulare quando accoppiato con l’immediata eliminazione delle cellule morenti mediante efferocitosi16. Tuttavia, difetti nell’efferocitosi o una mancanza di cellule fagocitiche possono portare all’accumulo di cellule apoptotiche, che poi subiscono la morte cellulare litica e infiammatoria17,18.
Le caspasi infiammatorie, tra cui caspasi-1 (uomo e topo), caspasi-4 e caspasi-5 (umana) e caspasi-11 (topo), sono state scoperte per essere attivate durante una forma di infiammatoria innata immune PCD (III-PCD) chiamata piroptosi. L’attivazione della caspasi-1 è associata alla formazione di inflammasomi, che sono complessi multiproteici contenenti un sensore immunitario innato citosolico, una molecola adattatrice (proteina simile allo speck associata all’apoptosi contenente una CARD [ASC]) e caspasi-1. La formazione di questo complesso consente alla caspasi-1 di sottoporsi ad autoproteolisi mediata dalla prossimità per rilasciare la sua forma attiva, che può scindere substrati bersaglio tra cui le citochine pro-infiammatorie interleuchina (IL)-1β e IL-18 e la molecola formante pori gasdermina D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspasi-11, caspasi-4 e caspasi-5 possono anche attivare GSDMD senza la formazione a monte dell’inflammasoma dopo aver rilevato PAMP come il lipopolisaccaride (LPS)19,20. Queste caspasi subiscono dimerizzazione seguita da oligomerizzazione e auto-scissione per l’attivazione dopo il legame a LPS citosolico, che porta all’attivazione non canonica dell’inflammasoma 24,25,26 e all’attivazione della caspasi-1 in modo intrinseco cellulare per indurre la maturazione di IL-1β e IL-18 20. La maturazione e il rilascio di queste citochine pro-infiammatorie caratterizzano queste caspasi come “infiammatorie”. Inoltre, è stato scoperto che la caspasi-8 apoptotica si localizza nell’inflammasoma, fornendo un collegamento tra i processi apoptotici e piroptotici. Gli studi hanno scoperto che la caspasi-8 apoptotica è anche fondamentale per regolare un’altra forma di PCD chiamata necroptosi. La perdita di caspasi-8 provoca l’attivazione spontanea della serina-treonina chinasi 3 (RIPK3)-mediata dalla linea mista chinasi chinasi (MLKL) per guidare la via III-PCD della necroptosi 27,28,29,30,31,32,33,34,35.
Mentre le caspasi sono state storicamente classificate come “apoptotiche” o “infiammatorie” in base al tipo di morte cellulare che iniziano, prove crescenti suggeriscono che esiste un’ampia diafonia tra le vie immunitarie innate della PCD attraverso le caspasi 3,4. Ad esempio, la caspasi-1 infiammatoria degli inflammasomi fende la caspasi-7 apoptotica nel suo sito di attivazione canonico34. L’attivazione della caspasi-1 può anche portare alla scissione di substrati apoptotici come la poli(ADP-ribosio) polimerasi 1 (PARP1)36. Nelle cellule prive di GSDMD, la caspasi-1 può anche scindere la caspasi-337,38. Inoltre, la caspasi-3 canonicamente apoptotica può scindere il gasdermina E (GSDME) per indurre PCD17,18 e anche elaborare GSDMD in una forma inattiva40. Inoltre, il reclutamento della caspasi-8 nel complesso dell’inflammasoma è stato osservato 39,40,41,42,43,44,45, e la caspasi-8 è un regolatore chiave dell’attivazione dell’inflammasoma canonico e non canonico 39. Ci sono anche ruoli sovrapposti e ridondanti per la caspasi-8 e la caspasi-1 in molte condizioni infiammatorie, e la PCD immunitaria innata caratterizzata dall’attivazione di componenti piroptotiche, apoptotiche e necroptotiche si verifica attraverso lo spettro della malattia 39,46,47,48,49,50.
Sulla base di questa diafonia tra caspasi infiammatorie e apoptotiche, è stata identificata una lacuna chiave nella comprensione meccanicistica dell’immunità innata e della PCD, che ha portato alla scoperta della PANoptosi. La PANoptosi è una forma unica di III-PCD che viene attivata in risposta a patogeni, PAMP, DAMP e alterazioni dell’omeostasi ed è regolata da PANoptosomi – complessi macromolecolari sfaccettati che integrano componenti provenienti da altre vie di morte cellulare 44,50,51,52,53,54,55 . La totalità degli effetti biologici nella PANoptosi non può essere spiegata individualmente dalla piroptosi, dall’apoptosi o dalla necroptosi da sola 3,4,35,36,39,46,47,48, poiché la PANoptosi è caratterizzata dall’attivazione di più caspasi, tra cui caspasi-1, caspasi-11, caspasi-8, caspasi-9, caspasi-3 e/o caspasi-7, a seconda del contesto 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . La panoptosi è stata sempre più implicata nelle malattie infettive e infiammatorie, così come nei tumori e nelle terapie antitumorali 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
Dato il ruolo essenziale delle caspasi attraverso le vie di morte cellulare, tra cui apoptosi, piroptosi, necroptosi e PANoptosi, è importante sviluppare tecniche per caratterizzare la loro attivazione e comprendere la piena complessità delle vie PCD. Il protocollo qui descrive un metodo per stimolare le cellule e misurare la successiva attivazione delle caspasi (Figura 1). Questo metodo sfrutta la scissione proteolitica delle caspasi, che è generalmente richiesta per la loro attivazione, come mezzo per studiarle. Attraverso il western blotting, le dimensioni delle proteine possono essere determinate, consentendo la chiara visualizzazione e differenziazione delle pro-caspasi inattive e delle loro forme attivate e scisse.
I principali vantaggi di questo protocollo sono 1) la sua capacità di valutare l’attivazione di più caspasi in parallelo da una singola popolazione di cellule endogene per determinare con maggiore precisione l’attivazione della PCD e 2) l’uso di tecniche di laboratorio relativamente semplici che non richiedono una formazione approfondita o attrezzature costose. I protocolli precedenti hanno utilizzato western blotting, reporter fluorescenti o colorazione anticorpale per monitorare l’attivazione della caspasi in supernatanti di coltura, lisati cellulari e tissutali, cellule intere tramite microscopia e in vivo 67,68,69,70,71, ma queste tecniche generalmente monitorano solo una o due caspasi in un campione. Inoltre, mentre substrati peptidici sintetici contenenti siti di scissione delle caspasi che diventano fluorescenti sulla scissione sono stati utilizzati per monitorare l’attivazione della caspasi nei lisati cellulari o tissutali69, questi substrati possono spesso essere scissi da più di una caspasi, rendendo difficile determinare l’attivazione specifica delle singole caspasi in questo sistema. Inoltre, l’uso del western blotting piuttosto che l’uso di reporter fluorescenti o altri metodi basati su tag consente ai ricercatori di utilizzare cellule endogene piuttosto che creare linee cellulari specifiche con geni reporter. Ci sono molteplici vantaggi nell’utilizzare cellule endogene, incluso il fatto che molte linee cellulari immortalizzate sono carenti di molecole chiave di morte cellulare72,73, che potrebbero influenzare i risultati. Inoltre, l’utilizzo di cellule endogene consente la valutazione di diversi tipi di cellule, come macrofagi, cellule epiteliali e cellule endoteliali, piuttosto che un singolo lignaggio. Il Western blotting è anche una tecnica relativamente semplice ed economica che può essere eseguita nei laboratori di tutto il mondo senza la necessità di attrezzature grandi e costose o configurazioni complicate.
Questo protocollo è ampiamente applicabile in tutta la biologia per comprendere sia le funzioni dipendenti dalla morte cellulare che quelle indipendenti dalla morte cellulare delle caspasi, compresi i loro ruoli e funzioni di impalcatura in altre vie di segnalazione infiammatoria74. L’applicazione di questo metodo consente un approccio unificato nello studio delle vie immunitarie innate della PCD e della segnalazione infiammatoria attraverso malattie e condizioni, e questo protocollo può essere utilizzato per identificare processi regolatori critici e connessioni meccanicistiche che informeranno lo sviluppo di future strategie terapeutiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il monitoraggio della scissione e dell’attivazione delle caspasi fornisce uno dei quadri più completi dell’attivazione immunitaria innata della PCD come parte della risposta immunitaria innata. Il protocollo qui descritto dimostra una strategia per monitorare l’attivazione delle caspasi in risposta alle infezioni da IAV, HSV1 e F. novicida e al trigger sterile LPS + ATP, ma numerosi altri stimoli possono indurre PCD e potrebbero essere utilizzati in questo metodo, come è stato dimostrato in diverse pubblicazio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Kanneganti per i loro commenti e suggerimenti, e ringraziamo J. Gullett, PhD, per il supporto all’editing scientifico. Il lavoro nel nostro laboratorio è supportato dalle sovvenzioni AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 e CA253095 (a T.-D.K.) e dall’American Lebanese Syrian Associated Charities (a T.-D.K.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| 0.45 μm filter | Millipore | SCHVU05RE | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| 12% polyacrylamide gel with 10 wells | Bio-Rad | 4561043 | |
| 12-well plate | Corning | 07-200-82 | |
| 18 G needle | BD Biosciences | 305195 | |
| 25 G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 50 mL tube | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Corning | 430597 | |
| 182-cm2 tissue culture flask | Genesee Scientific | 25-211 | |
| Accessory white trans tray | Cytiva | 29-0834-18 | |
| Anti–caspase-1 antibody | AdipoGen | AG-20B-0042-C100 | |
| Anti–caspase-11 antibody | Novus Biologicals | NB120-10454 | |
| Anti–caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| Anti–caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | 9492 | |
| Anti–caspase-8 antibody | Cell Signaling Technology | 4927 | |
| Anti–caspase-9 antibody | Cell Signaling Technology | 9504 | |
| Anti–cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Anti–cleaved caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | 9491 | |
| Anti–cleaved caspase-8 antibody | Cell Signaling Technology | 8592 | |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 315-035-047 | |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-047 | |
| Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 112-035-003 | |
| Anti–β-Actin antibody (C4) HRP | Santa Cruz | sc-47778 HRP | |
| ATP | InvivoGen | tlrl-atpl | |
| BBL Trypticase Soy Broth | BD Biosciences | 211768 | |
| Bead bath | Chemglass Life Sciences | CLS-4598-009 | |
| Biophotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| BME | Sigma | M6250 | |
| Bromophenol blue | Sigma | BO126 | |
| Cell scrapers | CellTreat Scientific Products | 229315 | |
| Chemiluminescence imager (Amersham 600) | Cytiva | 29083461 | |
| CO2 chamber | VetEquip | 901703 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 221S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995-073 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| Eelectrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1658004 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1620 | |
| Filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Francisella novicida (U112 strain) | BEI Resources | NR-13 | |
| Gel releaser | Bio-Rad | 1653320 | |
| Gentamycin | Gibco | 15750060 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| HCl | Sigma | H9892 | |
| Heat block | Fisher Scientific | 23-043-160 | |
| Herpes simplex virus 1 (HF strain) | ATCC | VR-260 | |
| High glucose DMEM | Sigma | D6171 | |
| Human anti–caspase-1 antibody | R&D Systems | MAB6215 | |
| Human anti–caspase-8 antibody | Enzo | ALX-804-242 | |
| Humidified incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Image analysis software | ImageJ | v1.53a | |
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440-053 | |
| Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) | constructed per Hoffmann et al. | ||
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | cell line for creating L929-conditioned media |
| L-cysteine | Thermo Fisher Scientific | BP376-100 | |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUF0500 | standard-sensitivity HRP substrate |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | cell line for determining IAV viral titer |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002401 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Nonfat dried milk powder | Kroger | ||
| NP-40 solution | Sigma | 492016 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| PhosSTOP | Roche | PHOSS-RO | |
| Power source | Bio-Rad | 164-5052 | |
| Protease inhibitor tablet | Sigma | S8820 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Rocking shaker | Labnet | S2035-E | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | |
| Super Signal Femto HRP substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | high-sensitivity HRP substrate |
| Tabletop centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004524 | |
| Trans-Blot semi-dry system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Tris | Sigma | TRIS-RO | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | tlrl-3pelps | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | cell line for determining HSV1 viral titer |
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