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Neuroscience

Hirnventrikuläre Mikroinjektionen von Lipopolysaccharid in Zebrafischlarven zur Beurteilung von Neuroinflammation und Neurotoxizität

Published: August 23, 2022
doi:
10.3791/64313
,
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade

Summary

Dieses Protokoll demonstriert die Mikroinjektion von Lipopolysaccharid in die ventrikuläre Hirnregion in einem Zebrafisch-Larvenmodell, um die resultierende neuroinflammatorische Reaktion und Neurotoxizität zu untersuchen.

Abstract

Neuroinflammation ist eine Schlüsselrolle bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, alternative in vivo Neuroinflammationsmodelle zu erforschen und zu entwickeln, um die Rolle der Neuroinflammation bei der Neurodegeneration zu verstehen. In dieser Studie wurde ein Larven-Zebrafisch-Modell der Neuroinflammation entwickelt und validiert, das durch ventrikuläre Mikroinjektion von Lipopolysaccharid (LPS) vermittelt wird, um eine Immunantwort und Neurotoxizität zu induzieren. Die transgenen Zebrafischlinien elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP und mpo:EGFP wurden zur Echtzeit-Quantifizierung der Lebensfähigkeit von Gehirnneuronen durch Fluoreszenz-Live-Bildgebung mit Fluoreszenzintensitätsanalyse verwendet. Das Bewegungsverhalten von Zebrafischlarven wurde automatisch mit einem Video-Tracking-Rekorder aufgezeichnet. Der Gehalt an Stickstoffmonoxid (NO) und die mRNA-Expressionsniveaus von entzündlichen Zytokinen einschließlich Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-1β (IL-1β) und humanem Tumornekrosefaktor α (TNF-α) wurden untersucht, um die LPS-induzierte Immunantwort im Larvenkopf des Zebrafisches zu beurteilen. 24 h nach der hirnventrikulären Injektion von LPS wurden bei Zebrafischlarven Neuronenverlust und Bewegungsmangel beobachtet. Darüber hinaus erhöhte die LPS-induzierte Neuroinflammation die NO-Freisetzung und die mRNA-Expression von IL-6, IL-1β und TNF-α im Kopf von 6 Tagen nach der Befruchtung (dpf) Zebrafischlarven und führte zur Rekrutierung von Neutrophilen im Zebrafischgehirn. In dieser Studie wurde die Injektion von Zebrafischen mit LPS in einer Konzentration von 2,5-5 mg/ml bei 5 dpf als optimale Bedingung für diesen pharmakologischen Neuroinflammationstest bestimmt. Dieses Protokoll stellt eine neue, schnelle und effiziente Methodik für die Mikroinjektion von LPS in Hirnventrikeln vor, um LPS-vermittelte Neuroinflammation und Neurotoxizität in einer Zebrafischlarve zu induzieren, die für die Untersuchung von Neuroinflammation nützlich ist und auch als Hochdurchsatz-In-vivo-Drogenscreening-Assay verwendet werden könnte.

Introduction

Neuroinflammation wurde als entscheidender antineurogener Faktor beschrieben, der an der Pathogenese mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) beteiligt ist1. Nach pathologischen Beleidigungen kann eine Neuroinflammation zu verschiedenen nachteiligen Folgen führen, einschließlich der Hemmung der Neurogenese und der Induktion des neuronalen Zelltods 2,3. In dem Prozess, der der Reaktion auf die Entzündungsinduktion zugrunde liegt, werden mehrere entzündliche Zytokine (wie TNF-α, IL-1β und IL-6) in den extrazellulären Raum sezerniert und wirken als entscheidende Komponenten beim Neuronentod und der Unterdrückung der Neurogenese 4,5,6.

Die Mikroinjektion von Entzündungsmediatoren (wie IL-1β, L-Arginin und Endotoxine) in das Gehirn kann eine neuronale Zellreduktion und Neuroinflammation verursachen 7,8,9. Lipopolysaccharid (LPS, Abbildung 1), ein pathogenes Endotoxin, das in der Zellwand gramnegativer Bakterien vorhanden ist, kann Neuroinflammation induzieren, Neurodegeneration verschlimmern und die Neurogenese bei Tieren reduzieren10. LPS-Injektion direkt in das ZNS des Mausgehirns erhöhte den Gehalt an Stickstoffmonoxid, entzündungsfördernden Zytokinen und anderen Regulatoren11. Darüber hinaus kann die stereotaktische Injektion von LPS in die lokale Gehirnumgebung eine übermäßige Produktion neurotoxischer Moleküle induzieren, was zu einer Beeinträchtigung der neuronalen Funktion und der anschließenden Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen führt 10,12,13,14,15. Im Bereich der Neurowissenschaften sind Live- und Zeitverlaufsmikroskopische Beobachtungen zellulärer und biologischer Prozesse in lebenden Organismen entscheidend für das Verständnis der Mechanismen, die der Pathogenese und der pharmakologischen Wirkung zugrunde liegen16. Die Live-Bildgebung von Mausmodellen der Neuroinflammation und Neurotoxizität wird jedoch grundlegend durch die begrenzte optische Eindringtiefe der Mikroskopie eingeschränkt, was funktionelle Bildgebung und Live-Beobachtung von Entwicklungsprozessen ausschließt17,18,19. Daher ist die Entwicklung alternativer Neuroinflammationsmodelle von großem Interesse, um die Untersuchung der pathologischen Entwicklung und des Mechanismus, der Neuroinflammation und Neurodegeneration zugrunde liegt, durch Live-Bildgebung zu erleichtern.

Zebrafisch (Danio rerio) hat sich aufgrund seines evolutionär konservierten angeborenen Immunsystems, der optischen Transparenz, der großen Embryonengelegegröße, der genetischen Traktierbarkeit und der Eignung für die In-vivo-Bildgebung als vielversprechendes Modell zur Untersuchung von Neuroinflammation und Neurodegeneration erwiesen 19,20,21,22,23 . Frühere Protokolle haben LPS entweder direkt in das Eigelb und den Hinterhirnventrikel von Zebrafischlarven ohne mechanistische Bewertung injiziert oder einfach LPS zu Fischwasser (Kulturmedium) hinzugefügt, um eine tödliche systemische Immunantwort zu induzieren24,25,26,27. Hier haben wir ein Protokoll für die Mikroinjektion von LPS in die Hirnventrikel entwickelt, um eine angeborene Immunantwort oder Neurotoxizität in den 5 Tagen nach der Befruchtung (DPF) Zebrafischlarven auszulösen. Diese Reaktion wird durch neuronalen Zellverlust, ein Defizit des Bewegungsverhaltens, eine erhöhte Nitritoxidfreisetzung, die Aktivierung der entzündlichen Genexpression und die Rekrutierung von Neutrophilen im Zebrafischgehirn 24 Stunden nach der Injektion nachgewiesen.

Protocol

AB-Wildtyp-Zebrafische und transgene Zebrafischlinien elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP und mpo:EGFP wurden vom Institute of Chinese Medical Sciences (ICMS) bezogen. Die ethische Genehmigung (UMARE-030-2017) für die Tierversuche wurde von der Ethikkommission für Tierforschung der Universität Macau erteilt, und das Protokoll folgt den Richtlinien der institutionellen Tierpflege. 1. Zebrafischembryonen- und Larvenhaltung Erzeugung von Zebrafischembryonen (200-300 Embryone…

Representative Results

Der hier beschriebene Workflow stellt eine neue, schnelle und effiziente Methodik zur Induktion von LPS-vermittelter Neuroinflammation und Neurotoxizität in Zebrafischlarven dar. In diesem beschriebenen Protokoll wurden 5 dpf Zebrafische mit LPS (Abbildung 1) in Hirnventrikel mit einem Mikroinjektor injiziert (Abbildung 2A-C). Die erfolgreiche Injektion in die Hirnventrikelstelle wurde anhand von 1% Evansblau-Färbung überprü…

Discussion

Immer mehr epidemiologische und experimentelle Daten implizieren chronische bakterielle und virale Infektionen als mögliche Risikofaktoren für neurodegenerative Erkrankungen36. Die Infektion löst die Aktivierung von Entzündungsprozessen und Immunantworten des Wirts aus37. Selbst wenn die Reaktion als Abwehrmechanismus wirkt, ist eine überaktivierte Entzündung schädlich für die Neurogenese, und die entzündliche Umgebung ermöglicht nicht das Überleben neugeborener …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Science and Technology Development Fund (FDCT) der Sonderverwaltungszone Macau unterstützt (Ref. FDCT0058/2019/A1 und 0016/2019/AKP), Forschungsausschuss, Universität Macau (MYRG2020-00183-ICMS und CPG2022-00023-ICMS) und National Natural Science Foundation of China (Nr. 81803398).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology
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He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).
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