JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Hersenventrikelmicro-injecties van lipopolysaccharide in larvale zebravissen om neuro-inflammatie en neurotoxiciteit te beoordelen

Published: August 23, 2022
doi:
10.3791/64313
,
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade

Summary

Dit protocol demonstreert de micro-injectie van lipopolysaccharide in het ventriculaire gebied van de hersenen in een zebravislarvemodel om de resulterende neuro-inflammatoire respons en neurotoxiciteit te bestuderen.

Abstract

Neuro-inflammatie is een belangrijke speler bij verschillende neurologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve ziekten. Daarom is het van groot belang om alternatieve in vivo neuro-inflammatiemodellen te onderzoeken en te ontwikkelen om de rol van neuro-inflammatie bij neurodegeneratie te begrijpen. In deze studie werd een larvaal zebravismodel van neuro-inflammatie gemedieerd door ventriculaire microinjectie van lipopolysaccharide (LPS) ontwikkeld en gevalideerd. De transgene zebravislijnen elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP en mpo:EGFP werden gebruikt voor real-time kwantificering van de levensvatbaarheid van hersenneuronen door fluorescentie live imaging geïntegreerd met fluorescentie intensiteitsanalyse. Het locomotorische gedrag van zebravislarven werd automatisch vastgelegd met behulp van een videotrackingrecorder. Het gehalte aan stikstofmonoxide (NO) en de mRNA-expressieniveaus van inflammatoire cytokines, waaronder interleukine-6 (IL-6), interleukine-1β (IL-1β) en menselijke tumornecrosefactor α (TNF-α) werden onderzocht om de LPS-geïnduceerde immuunrespons in de larvale zebraviskop te beoordelen. Na 24 uur na de hersenventrikelinjectie van LPS werden verlies van neuronen en locomotiedeficiëntie waargenomen bij zebravislarven. Bovendien verhoogde LPS-geïnduceerde neuro-inflammatie de NO-afgifte en de mRNA-expressie van IL-6, IL-1β en TNF-α in het hoofd van 6 dagen na de bevruchting (dpf) zebravislarven, en resulteerde in de rekrutering van neutrofielen in de hersenen van zebravissen. In deze studie werd injectie van zebravissen met LPS in een concentratie van 2,5-5 mg/ml bij 5 dpf bepaald als de optimale conditie voor deze farmacologische neuro-inflammatietest. Dit protocol presenteert een nieuwe, snelle en efficiënte methodologie voor micro-injectie van LPS in de hersenen om LPS-gemedieerde neuro-inflammatie en neurotoxiciteit in een zebravislarve te induceren, wat nuttig is voor het bestuderen van neuro-inflammatie en ook kan worden gebruikt als een high-throughput in vivo screening assay voor geneesmiddelen.

Introduction

Neuro-inflammatie is beschreven als een cruciale anti-neurogene factor die betrokken is bij de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS)1. Na pathologische beledigingen kan neuro-inflammatie leiden tot verschillende nadelige gevolgen, waaronder remming van neurogenese en inductie van neuronale celdood 2,3. In het proces dat ten grondslag ligt aan de respons op ontstekingsinductie, worden meerdere inflammatoire cytokines (zoals TNF-α, IL-1β en IL-6) uitgescheiden in de extracellulaire ruimte en fungeren als cruciale componenten in neurondood en de onderdrukking van neurogenese 4,5,6.

Micro-injectie van ontstekingsmediatoren (zoals IL-1β, L-arginine en endotoxinen) in de hersenen kan neuronale celreductie en neuro-inflammatie veroorzaken 7,8,9. Lipopolysaccharide (LPS, figuur 1), een pathogeen endotoxine dat aanwezig is in de celwand van Gram-negatieve bacteriën, kan neuro-inflammatie induceren, neurodegeneratie verergeren en neurogenese bij dieren verminderen10. LPS-injectie rechtstreeks in het CZS van de muizenhersenen verhoogde niveaus van stikstofmonoxide, pro-inflammatoire cytokines en andere regulatoren11. Bovendien kan stereotaxische injectie van LPS in de lokale hersenomgeving overmatige productie van neurotoxische moleculen induceren, wat resulteert in een verminderde neuronale functie en de daaropvolgende ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekten 10,12,13,14,15. Op het gebied van de neurowetenschappen zijn live en tijdsverloop microscopische waarnemingen van cellulaire en biologische processen in levende organismen cruciaal voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan pathogenese en farmacologische werking16. Live beeldvorming van muismodellen van neuro-inflammatie en neurotoxiciteit wordt echter fundamenteel beperkt door de beperkte optische penetratiediepte van microscopie, die functionele beeldvorming en live observatie van ontwikkelingsprocessen uitsluit 17,18,19. Daarom is de ontwikkeling van alternatieve neuro-inflammatiemodellen van groot belang om de studie van pathologische ontwikkeling en het mechanisme dat ten grondslag ligt aan neuro-inflammatie en neurodegeneratie door live beeldvorming te vergemakkelijken.

Zebravis (Danio rerio) is naar voren gekomen als een veelbelovend model om neuro-inflammatie en neurodegeneratie te bestuderen vanwege zijn evolutionair geconserveerde aangeboren immuunsysteem, optische transparantie, grote embryokoppelingsgrootte, genetische tractie en geschiktheid voor in vivo beeldvorming 19,20,21,22,23 . Eerdere protocollen hebben ofwel lps rechtstreeks geïnjecteerd in de dooier en achterhersenentrik van larvale zebravissen zonder mechanistische beoordeling, of eenvoudig LPS toegevoegd aan viswater (kweekmedium) om een dodelijke systemische immuunrespons te induceren 24,25,26,27. Hierin hebben we een protocol ontwikkeld voor micro-injectie van LPS in de hersenventrikels, om een aangeboren immuunrespons of neurotoxiciteit te activeren in de 5 dagen na de bevruchting (dpf) zebravislarven. Deze respons wordt aangetoond door neuronaal celverlies, bewegingsvermogenstekort, verhoogde afgifte van stikstofmonoxide, activering van inflammatoire genexpressie en rekrutering van neutrofielen in de hersenen van zebravissen 24 uur na injectie.

Protocol

AB wild-type zebravis en transgene zebravislijnen elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP en mpo:EGFP werden verkregen van het Institute of Chinese Medical Sciences (ICMS). Ethische goedkeuring (UMARE-030-2017) voor de dierproeven werd verleend door de Animal Research Ethics Committee, University of Macau, en het protocol volgt de richtlijnen voor institutionele dierverzorging. 1. Zebravis embryo en larvale veehouderij Genereer zebravisembryo’s (200-300 embryo’s per paring) door…

Representative Results

De hier beschreven workflow presenteert een nieuwe, snelle en efficiënte methodologie voor het induceren van LPS-gemedieerde neuro-inflammatie en neurotoxiciteit bij zebravislarven. In dit beschreven protocol werden 5 dpf zebravissen geïnjecteerd met LPS (figuur 1) in hersenventrikels met behulp van een micro-injector (figuur 2A-C). Succesvolle injectie in de hersenkamer werd geverifieerd met behulp van 1% Evans blauwe vlek (<…

Discussion

Een toenemende hoeveelheid epidemiologische en experimentele gegevens impliceert chronische bacteriële en virale infecties als mogelijke risicofactoren voor neurodegeneratieve ziekten36. De infectie veroorzaakt de activering van ontstekingsprocessen en immuunresponsen van de gastheer37. Zelfs als de reactie fungeert als een verdedigingsmechanisme, is overactiveerde ontsteking schadelijk voor neurogenese en staat de ontstekingsomgeving de overleving van pasgeboren neuronen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Science and Technology Development Fund (FDCT) van Macao SAR (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 en 0016/2019/AKP), Onderzoekscommissie, Universiteit van Macau (MYRG2020-00183-ICMS en CPG2022-00023-ICMS) en National Natural Science Foundation of China (nr. 81803398).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
  2. Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
  3. Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
  4. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  5. Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
  6. Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
  7. Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
  8. Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
  9. Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
  10. Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson’s disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
  11. Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
  12. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson’s disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  13. Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
  14. Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
  15. Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson’s disease. Parkinson’s Disease. 2011, 327089 (2011).
  16. Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
  17. Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
  18. Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
  19. Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer’s disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
  20. Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
  21. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
  22. Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
  23. Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
  24. Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
  25. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
  26. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  27. Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9′-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
  28. He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
  29. Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
  30. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
  31. d’Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
  32. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  33. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  34. Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
  35. Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
  36. De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
  37. Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
  38. Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
  39. Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
  40. Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
  41. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
  42. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
  43. Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
  44. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  45. Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
  46. Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
  47. Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer’s disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer’s Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
  48. Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
  49. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
  50. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
  51. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  52. Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
  53. Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
  54. Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).

Tags

Brain VentricleMicroinjectionLipopolysaccharideNeuroinflammationNeurotoxicityZebrafishIn Vivo ModelAnti-neuroinflammatory DrugsGlass CapillaryMicromanipulatorAgaroseAnesthesia
check_url/64313?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image