Sædopsamling og computerassisteret sædanalyse i Teleost-modellen japansk Medaka (Oryzias latipes)

Summary

Denne artikel beskriver to hurtige og effektive metoder til opsamling af sæd fra den lille model fisk medaka (Oryzias latipes), samt en protokol til pålidelig vurdering af sædkvalitet ved hjælp af computerassisteret sædanalyse (CASA).

Abstract

Japansk medaka (Oryzias latipes) er en teleostfisk og en ny hvirveldyrsmodel til økotoksikologi, udviklings-, genetik- og fysiologiforskning. Medaka bruges også i vid udstrækning til at undersøge hvirveldyrs reproduktion, hvilket er en væsentlig biologisk funktion, da det tillader en art at fortsætte. Sædkvalitet er en vigtig indikator for mandlig fertilitet og dermed reproduktionssucces. Teknikker til ekstraktion af sæd og sædanalyse er veldokumenterede for mange arter, herunder teleostfisk. Indsamling af sæd er relativt enkel i større fisk, men kan være mere kompliceret i små modelfisk, da de producerer mindre sæd og er mere sarte. Denne artikel beskriver derfor to metoder til sædopsamling i den lille modelfisk, japansk medaka: testikler dissektion og abdominal massage. Dette papir viser, at begge tilgange er mulige for medaka og viser, at mavemassage kan udføres gentagne gange, da fisken hurtigt kommer sig efter proceduren. Denne artikel beskriver også en protokol for computerassisteret sædanalyse i medaka for objektivt at vurdere flere vigtige indikatorer for medaka sædkvalitet (motilitet, progressivitet, varighed af motilitet, relativ koncentration). Disse procedurer, der er specificeret til denne nyttige lille teleostmodel, vil i høj grad forbedre forståelsen af de miljømæssige, fysiologiske og genetiske faktorer, der påvirker fertiliteten hos hvirveldyrmænd.

Introduction

Japansk medaka er en lille, æglæggende ferskvandsteleostfisk hjemmehørende i Østasien. Medaka er blevet et fremragende hvirveldyrmodelsystem til økotoksikologi, udviklingsgenetik, genomik og evolutionær biologi og fysiologistudier ^1,2. I lighed med de populære zebrafisk er de relativt lette at opdrætte og meget resistente over for mange almindelige fiskesygdomme ^1,2. Der er flere fordele ved at bruge medaka som model, herunder en kort generationstid, gennemsigtige embryoner ^1,2 og et sekventeret genom³. I modsætning til zebrafisk har medaka et kønsbestemmende gen 4 samt en høj temperatur (fra^4-40 ° C) og saltholdighed (euryhaline arter) tolerance⁵. Også mange genetiske og anatomiske værktøjer samt protokoller 6,7,8,9,10,11,12 er blevet udviklet i medaka for at lette studiet af dets biologi.

Reproduktion er en væsentlig fysiologisk funktion, da den tillader en art at fortsætte. Reproduktion af hvirveldyr kræver et utal af præcist orkestrerede begivenheder, herunder produktion af oocytter hos kvinder og produktion af sæd hos mænd. Sperm er unikke celler, der produceres gennem den komplekse proces med spermatogenese, hvor der er en række kontrolpunkter på plads for at garantere levering af et produkt af høj kvalitet¹³. Gametkvalitet er blevet et fokus i akvakultur- og fiskebestandsundersøgelser på grund af dens indvirkning på befrugtningssucces og larveoverlevelse. Sædkvalitet er derfor en vigtig indikator for mandlig fertilitet hos hvirveldyr.

Tre nyttige faktorer til vurdering af fisk sædkvalitet er bevægelighed, progressivitet, og lang levetid. Procent motilitet og progressiv motilitet er almindelige indikatorer for sædkvalitet, da progressiv bevægelse er nødvendig for og korrelerer stærkt med befrugtningssucces^14,15. Bevægelsesvarighed er også en vigtig indikator hos fisk, da sædceller forbliver fuldt bevægelige i mindre end 2 minutter hos de fleste teleostarter, og sædens bane generelt er mindre lineær end hos pattedyr¹⁵. Imidlertid var mange undersøgelser, der vurderede sædmotilitet i fortiden, afhængige af subjektive eller semikvantitative metoder til analyse af sæd^15,16. For eksempel er sædmotilitet i medaka tidligere blevet estimeret visuelt under et mikroskop¹⁷. Det er også blevet estimeret ved at registrere sædbevægelse og bruge billeddannelsessoftware til at flette rammer og måle svømmebane og hastighed^18,19,20. Sådanne tilgange mangler ofte robusthed, hvilket giver forskellige resultater alt efter den person, der udfører analysen^15,21.

Computerassisteret sædanalyse (CASA) blev oprindeligt udviklet til pattedyr. CASA er en hurtig kvantitativ metode til at vurdere sædkvalitet ved at registrere og måle hastighed og bane på en automatiseret måde¹⁵. I fisk er det blevet brugt i forskellige arter til at overvåge virkningerne af flere vandforurenende stoffer på sædkvaliteten, til at identificere interessante forfædre til at forbedre yngelbestanden, til at forbedre effektiviteten af kryopræservering og opbevaring og til at optimere betingelserne for befrugtning¹⁵. Derfor er det et kraftfuldt værktøj til pålidelig vurdering af sædkvalitet hos forskellige hvirveldyrarter. På grund af den vigtige mangfoldighed i reproduktive strategier mellem fisk adskiller sæd fra teleostfisk sig imidlertid fra pattedyr og fra en fiskeart til en anden. Teleostfisk, der primært befrugter æg eksternt ved at frigive kønsceller i vand, har stærkt koncentreret sæd, der er relativt enkle i struktur uden akrosom, i modsætning til pattedyr, der befrugter internt og derfor ikke behøver at kompensere for fortynding i vand, men skal modstå mere tyktflydende væsker¹⁴. Derudover bevæger sæd fra de fleste fisk sig hurtigt, men er fuldt bevægelige i mindre end 2 minutter efter aktivering, selvom der er flere undtagelser^15,22. Fordi motiliteten kan falde hurtigt hos de fleste fisk, skal der udvises ekstrem forsigtighed med tidspunktet for analyse efter aktivering, når man bestemmer en sædanalyseprotokol for fisk.

Reproduktion er et af de områder inden for biologi, hvor teleosts og medaka er blevet brugt i vid udstrækning som modelorganismer. Faktisk viser medaka-mænd interessant reproduktiv og social adfærd, såsom mage, der bevogter^23,24. Derudover findes der flere transgene linjer til at studere den neuroendokrine kontrol af reproduktion i denne art^25,26,27. Sædprøvetagning, en procedure, der er relativt enkel i større fisk, kan være mere kompliceret i små modelfisk, da de producerer mindre sæd og er mere sarte. Af denne grund er de fleste undersøgelser, der involverer sædprøvetagning i medaka-ekstraktmilt (fiskesæd) ved knusning dissekeret testikler 17,28,29,30. Et par undersøgelser bruger også en modificeret mavemassage til at udtrykke milten direkte til aktiverende medium^18,19,20; Men med denne metode er det svært at visualisere mængden og farven på milt ekstraheret. I zebrafisk bruges abdominal massage almindeligvis til at udtrykke milt, som straks opsamles i et kapillarrør^31,32,33. Denne metode muliggør estimering af mængden af milt samt observation af ejakulatfarve, som er en hurtig og enkel indikator for sædkvalitet^32,33. Derfor mangler der en klar og velbeskrevet protokol for sædopsamling og analyse for medaka.

Denne artikel beskriver derfor to metoder til sædopsamling i den lille model fisk japansk medaka: testikler dissektion og abdominal massage med kapillarrør. Det viser, at begge tilgange er mulige for medaka og viser, at mavemassage kan udføres gentagne gange, da fisken hurtigt kommer sig efter proceduren. Det beskriver også en protokol for computerassisteret sædanalyse i medaka for pålideligt at måle flere vigtige indikatorer for medaka sædkvalitet (motilitet, progressivitet, lang levetid og relativ sædkoncentration). Disse procedurer, der er specificeret til denne nyttige lille teleostmodel, vil i høj grad forbedre forståelsen af de miljømæssige, fysiologiske og genetiske faktorer, der påvirker fertiliteten hos hvirveldyrmænd.

Protocol

Alle forsøg og håndtering af dyr blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne om forsøgsdyrs velfærd ved Norges Biovidenskabelige Universitet (NMBU). Forsøgene blev udført ved hjælp af voksen (6-9 måneder gammel) mandlig japansk medaka (Hd-rR-stamme) opdrættet ved NMBU (Ås, Norge). Metoderne blev også kort testet i 9 måneder gammel mandlig japansk medaka (CAB-stamme) opdrættet ved National Research Institute for Agriculture, Food and the Environment (INRAE, Rennes, Frankrig). …

Representative Results

Type data opnåetSpermmotilitetsanalyse fra SCA Evolution-softwaren giver data om motilitet (procentdel af bevægelig og immotil sæd) samt progressivitet (procentdel af progressiv og ikke-progressiv sæd) og hastighed (procentdel af hurtig, medium og langsomt bevægende sæd). Det kombinerer også progressivitet og hastighed (hurtig progressiv, medium progressiv, ikke-progressiv). Disse etiketter er baseret på målinger (figur 3A) og beregninger (f…

Discussion

Osmolalitet er en vigtig faktor i aktiveringen af fiskesæd^36,37. Generelt er sædceller immotile i testiklerne og bliver bevægelige i medier, der er hyperosmotiske i forhold til sædvæske til marine fisk og hypo-osmotiske i forhold til sædvæske til ferskvandsfisk³⁷. I lighed med blod er sædplasma i ferskvandsfisk typisk lavere end for havfisk (ca. 300 mOsmol/kg sammenlignet med 400 mOsmol/kg)^22,37<s…

Materials

1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040