Collecte de sperme et analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes dans le modèle téléostéen japonais Medaka (Oryzias latipes)

Summary

Cet article décrit deux méthodes rapides et efficaces pour collecter le sperme du petit poisson modèle medaka (Oryzias latipes), ainsi qu’un protocole pour évaluer de manière fiable la qualité du sperme à l’aide de l’analyse assistée par ordinateur du sperme (CASA).

Abstract

Le médaka japonais (Oryzias latipes) est un poisson téléostéen et un modèle vertébré émergent pour la recherche en écotoxicologie, développement, génétique et physiologie. Medaka est également largement utilisé pour étudier la reproduction des vertébrés, qui est une fonction biologique essentielle car elle permet à une espèce de se perpétuer. La qualité du sperme est un indicateur important de la fertilité masculine et, par conséquent, du succès de la reproduction. Les techniques d’extraction du sperme et d’analyse du sperme sont bien documentées pour de nombreuses espèces, y compris les poissons téléostéens. La collecte de sperme est relativement simple chez les gros poissons, mais peut être plus compliquée chez les petits poissons modèles car ils produisent moins de spermatozoïdes et sont plus délicats. Cet article décrit donc deux méthodes de collecte de sperme chez le petit poisson modèle, le médaka japonais: la dissection des testicules et le massage abdominal. Cet article démontre que les deux approches sont réalisables pour le medaka et montre que le massage abdominal peut être effectué un nombre répété de fois car les poissons se remettent rapidement de la procédure. Cet article décrit également un protocole d’analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes en medaka pour évaluer objectivement plusieurs indicateurs importants de la qualité du sperme medaka (motilité, progressivité, durée de motilité, concentration relative). Ces procédures, spécifiées pour ce modèle utile de petits téléostéens, amélioreront grandement la compréhension des facteurs environnementaux, physiologiques et génétiques influençant la fertilité chez les mâles vertébrés.

Introduction

Le medaka japonais est un petit poisson téléostéen d’eau douce pondeur originaire d’Asie de l’Est. Medaka est devenu un excellent système modèle de vertébrés pour l’écotoxicologie, la génétique du développement, la génomique et les études de biologie et de physiologie évolutives ^1,2. Semblables au poisson zèbre populaire, ils sont relativement faciles à élever et très résistants à de nombreuses maladies courantes^des poissons ^1,2. L’utilisation de medaka comme modèle présente plusieurs avantages, notamment un temps de génération court, des embryons transparents ^1,2 et un génome séquencé³. Contrairement au poisson zèbre, le médaka a un gène déterminant le sexe 4 ainsi qu’une tolérance élevée à la température (de⁴ à 40 °C) et à la salinité (espèces euryhalines)⁵. En outre, de nombreux outils génétiques et anatomiques, ainsi que les protocoles 6,7,8,9,10,11,12^, ont été développés en medaka pour faciliter l’étude de sa biologie.

La reproduction est une fonction physiologique essentielle car elle permet à une espèce de se perpétuer. La reproduction des vertébrés nécessite une myriade d’événements orchestrés avec précision, y compris la production d’ovocytes chez les femelles et la production de spermatozoïdes chez les mâles. Les spermatozoïdes sont des cellules uniques, produites par le processus complexe de la spermatogenèse, dans lequel un certain nombre de points de contrôle sont en place pour garantir la livraison d’un produit de haute qualité¹³. La qualité des gamètes est devenue une priorité dans les études sur l’aquaculture et les populations de poissons en raison de son impact sur le succès de la fertilisation et la survie des larves. La qualité du sperme est donc un indicateur important de la fertilité masculine chez les vertébrés.

Trois facteurs utiles pour évaluer la qualité du sperme de poisson sont la motilité, la progressivité et la longévité. Le pourcentage de motilité et la motilité progressive sont des indicateurs courants de la qualité du sperme, car un mouvement progressif est nécessaire et fortement corrélé avec le succès de la fécondation^14,15. La durée du mouvement est également un indicateur important chez les poissons, car les spermatozoïdes restent complètement mobiles pendant moins de 2 minutes chez la plupart des espèces de téléostéens et la trajectoire des spermatozoïdes est généralement moins linéaire que chez les^{mammifères15}. Cependant, de nombreuses études évaluant la motilité des spermatozoïdes dans le passé reposaient sur des méthodes subjectives ou semi-quantitatives d’analyse des spermatozoïdes^15,16. Par exemple, la motilité des spermatozoïdes dans le médaka a été estimée dans le passé visuellement au microscope¹⁷. Il a également été estimé en enregistrant le mouvement des spermatozoïdes et en utilisant un logiciel d’imagerie pour fusionner les images et mesurer la trajectoire de nage et la vitesse^18,19,20. De telles approches manquent souvent de robustesse, fournissant des résultats différents selon la personne effectuant l’analyse^15,21.

L’analyse assistée par ordinateur du sperme (CASA) a été initialement développée pour les mammifères. CASA est une méthode quantitative rapide pour évaluer la qualité du sperme en enregistrant et en mesurant la vitesse et la trajectoire de manière automatisée¹⁵. Chez les poissons, il a été utilisé chez différentes espèces pour surveiller les effets de plusieurs polluants de l’eau sur la qualité du sperme, pour identifier des progéniteurs intéressants pour améliorer le stock de géniteurs, pour améliorer l’efficacité de la cryoconservation et du stockage, et pour optimiser les conditions de fécondation¹⁵. Par conséquent, il s’agit d’un outil puissant pour évaluer de manière fiable la qualité des spermatozoïdes chez différentes espèces de vertébrés. Cependant, en raison de la diversité importante des stratégies de reproduction entre les poissons, le sperme des poissons téléostéens diffère de celui des mammifères et d’une espèce de poisson à l’autre. Les poissons téléostéens, qui fécondent principalement les œufs à l’extérieur en libérant des gamètes dans l’eau, ont des spermatozoïdes très concentrés dont la structure est relativement simple sans acrosome, contrairement aux mammifères, qui fertilisent à l’intérieur et n’ont donc pas à compenser la dilution dans l’eau, mais doivent résister à des fluides plus visqueux¹⁴. De plus, les spermatozoïdes de la plupart des poissons se déplacent rapidement mais sont complètement mobiles pendant moins de 2 minutes après l’activation, bien qu’il y ait plusieurs exceptions^15,22. Étant donné que la motilité peut diminuer rapidement chez la plupart des poissons, il convient d’être extrêmement prudent avec le moment de l’analyse après l’activation lors de la détermination d’un protocole d’analyse du sperme pour les poissons.

La reproduction est l’un des domaines de la biologie dans lequel les téléostéens et les médakas ont été largement utilisés comme organismes modèles. En effet, les mâles medaka montrent des comportements reproductifs et sociaux intéressants, tels que la garde du partenaire^23,24. De plus, plusieurs lignées transgéniques existent pour étudier le contrôle neuroendocrinien de la reproduction chez cette espèce^25,26,27. L’échantillonnage du sperme, une procédure relativement simple chez les gros poissons, peut être plus compliqué chez les petits poissons modèles car ils produisent moins de spermatozoïdes et sont plus délicats. Pour cette raison, la plupart des études impliquant l’échantillonnage de sperme dans medaka extraient de la laitance (sperme de poisson) par écrasement de testicules disséqués 17,28,29,30. Quelques études utilisent également un massage abdominal modifié pour exprimer la laitance directement dans le milieu activateur^18,19,20; Cependant, avec cette méthode, il est difficile de visualiser la quantité et la couleur de la laitance extraite. Chez le poisson zèbre, le massage abdominal est couramment utilisé pour exprimer la laitance, qui est immédiatement recueillie dans un tube capillaire^31,32,33. Cette méthode permet d’estimer le volume de laitance, ainsi que d’observer la couleur de l’éjaculat, qui est un indicateur rapide et simple de la qualité du sperme^32,33. Par conséquent, il manque un protocole clair et bien décrit pour la collecte et l’analyse du sperme pour medaka.

Cet article décrit donc deux méthodes de collecte de sperme chez le petit modèle de poisson japonais médaka : la dissection testiculaire et le massage abdominal avec tubes capillaires. Il démontre que les deux approches sont réalisables pour le medaka et montre que le massage abdominal peut être effectué un nombre répété de fois car le poisson se remet rapidement de la procédure. Il décrit également un protocole d’analyse assistée par ordinateur du sperme dans medaka pour mesurer de manière fiable plusieurs indicateurs importants de la qualité du sperme medaka (motilité, progressivité, longévité et concentration relative de spermatozoïdes). Ces procédures, spécifiées pour ce modèle utile de petits téléostéens, amélioreront grandement la compréhension des facteurs environnementaux, physiologiques et génétiques influençant la fertilité chez les mâles vertébrés.

Protocol

Toutes les expériences et manipulations des animaux ont été menées conformément aux recommandations sur le bien-être animal expérimental à l’Université norvégienne des sciences de la vie (NMBU). Les expériences ont été réalisées en utilisant des medakas japonais mâles adultes (âgés de 6 à 9 mois) (souche Hd-rR) élevés à la NMBU (Ås, Norvège). Les méthodes ont également été brièvement testées sur un medaka japonais mâle (souche CAB) âgé de 9 mois élevé à l’Institut national de reche…

Representative Results

Type de données obtenuesL’analyse de la motilité des spermatozoïdes du logiciel SCA Evolution fournit des données sur la motilité (pourcentage de spermatozoïdes mobiles et immotiles), ainsi que sur la progressivité (pourcentage de spermatozoïdes progressifs et non progressifs) et la vitesse (pourcentage de spermatozoïdes rapides, moyens et lents). Il combine également progressivité et vélocité (rapide progressif, moyen progressif, non progressif). Ces étiquettes sont basées sur des m…

Discussion

L’osmolalité est un facteur important dans l’activation des spermatozoïdes de poisson^36,37. En général, les spermatozoïdes sont immotiles dans les testicules et deviennent mobiles dans les milieux hyperosmotiques par rapport au liquide séminal pour les poissons marins, et hypo-osmotiques par rapport au liquide séminal pour les poissons d’eau douce³⁷. Comme dans le sang, le plasma séminal chez les poissons d’eau douce est g?…

Materials

1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040