टेलोस्ट मॉडल जापानी मेडाका (ओरीज़ियास लैटिप्स) में शुक्राणु संग्रह और कंप्यूटर-सहायक शुक्राणु विश्लेषण
Summary
यह लेख छोटे मॉडल मछली मेडाका (ओरिज़ियास लैटिप्स) से शुक्राणु एकत्र करने के लिए दो त्वरित और कुशल तरीकों का वर्णन करता है, साथ ही कंप्यूटर-सहायता प्राप्त शुक्राणु विश्लेषण (सीएएसए) का उपयोग करके शुक्राणु की गुणवत्ता का विश्वसनीय रूप से आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी है।
Abstract
जापानी मेडाका (ओरिज़ियास लैटिप्स) एक टेलोस्ट मछली है और इकोटॉक्सिकोलॉजी, विकास, आनुवंशिकी और शरीर विज्ञान अनुसंधान के लिए एक उभरता हुआ कशेरुक मॉडल है। मेडाका का उपयोग कशेरुक प्रजनन की जांच के लिए भी बड़े पैमाने पर किया जाता है, जो एक आवश्यक जैविक कार्य है क्योंकि यह एक प्रजाति को बनाए रखने की अनुमति देता है। शुक्राणु की गुणवत्ता पुरुष प्रजनन क्षमता का एक महत्वपूर्ण संकेतक है और इस प्रकार, प्रजनन की सफलता। शुक्राणु और शुक्राणु विश्लेषण निकालने की तकनीक कई प्रजातियों के लिए अच्छी तरह से प्रलेखित हैं, जिसमें टेलोस्ट मछली भी शामिल है। शुक्राणु एकत्र करना बड़ी मछली में अपेक्षाकृत सरल है, लेकिन छोटी मॉडल मछली में अधिक जटिल हो सकता है क्योंकि वे कम शुक्राणु का उत्पादन करते हैं और अधिक नाजुक होते हैं। इसलिए, यह लेख छोटे मॉडल मछली, जापानी मेडाका में शुक्राणु संग्रह के दो तरीकों का वर्णन करता है: वृषण विच्छेदन और पेट की मालिश। यह पेपर दर्शाता है कि मेडका के लिए दोनों दृष्टिकोण संभव हैं और दिखाता है कि पेट की मालिश को बार-बार किया जा सकता है क्योंकि मछली प्रक्रिया से जल्दी से ठीक हो जाती है। यह लेख मेडाका में कंप्यूटर-सहायता प्राप्त शुक्राणु विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन करता है ताकि मेडाका शुक्राणु की गुणवत्ता (गतिशीलता, प्रगति, गतिशीलता की अवधि, सापेक्ष एकाग्रता) के कई महत्वपूर्ण संकेतकों का निष्पक्ष रूप से आकलन किया जा सके। इस उपयोगी छोटे टेलोस्ट मॉडल के लिए निर्दिष्ट ये प्रक्रियाएं, कशेरुक पुरुषों में प्रजनन क्षमता को प्रभावित करने वाले पर्यावरणीय, शारीरिक और आनुवंशिक कारकों की समझ को बहुत बढ़ाएंगी।
Introduction
जापानी मेडाका एक छोटी, अंडे देने वाली मीठे पानी की टेलोस्ट मछली है जो पूर्वी एशिया की मूल निवासी है। मेडाका इकोटॉक्सिकोलॉजी, विकासात्मक आनुवंशिकी, जीनोमिक्स, और विकासवादी जीव विज्ञान और शरीर विज्ञान अध्ययन 1,2 के लिए एक उत्कृष्ट कशेरुक मॉडल प्रणाली बन गया है। लोकप्रिय ज़ेबराफ़िश के समान, वे प्रजनन करने में अपेक्षाकृत आसान हैं और कई सामान्य मछली रोगों के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी हैं 1,2. एक मॉडल के रूप में मेडाका का उपयोग करने के कई फायदे हैं, जिसमें एक छोटी पीढ़ी का समय, पारदर्शी भ्रूण 1,2 और एक अनुक्रमित जीनोम3 शामिल हैं। ज़ेबराफिश के विपरीत, मेडाका में एक लिंग-निर्धारण जीन4 के साथ-साथ एक उच्च तापमान (4-40 डिग्री सेल्सियस से) और लवणता (यूरीहैलाइन प्रजाति) सहिष्णुता5 है। इसके अलावा, कई आनुवंशिक और शारीरिक उपकरण, साथ ही प्रोटोकॉल 6,7,8,9,10,11,12, इसके जीव विज्ञान के अध्ययन की सुविधा के लिए मेडाका में विकसित किए गए हैं।
प्रजनन एक आवश्यक शारीरिक कार्य है क्योंकि यह एक प्रजाति को बनाए रखने की अनुमति देता है। कशेरुक प्रजनन के लिए सटीक रूप से योजनाबद्ध घटनाओं के असंख्य की आवश्यकता होती है, जिसमें महिलाओं में अंडाणुओं का उत्पादन और पुरुषों में शुक्राणु का उत्पादन शामिल है। शुक्राणु अद्वितीय कोशिकाएं हैं, जो शुक्राणुजनन की जटिल प्रक्रिया के माध्यम से निर्मित होती हैं, जिसमें उच्च गुणवत्ता वाले उत्पाद13 के वितरण की गारंटी देने के लिए कई चेकपॉइंट होते हैं। निषेचन की सफलता और लार्वा अस्तित्व पर इसके प्रभाव के कारण गैमेट गुणवत्ता जलीय कृषि और मछली की आबादी के अध्ययन में एक फोकस बन गई है। इसलिए, शुक्राणु की गुणवत्ता कशेरुक में पुरुष प्रजनन क्षमता का एक महत्वपूर्ण संकेतक है।
मछली शुक्राणु की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए तीन उपयोगी कारक गतिशीलता, प्रगति और दीर्घायु हैं। प्रतिशत गतिशीलता और प्रगतिशील गतिशीलता शुक्राणु की गुणवत्ता के सामान्य संकेतक हैं क्योंकि प्रगतिशील गति के लिए आवश्यक है और निषेचन सफलता14,15 के साथ दृढ़ता से संबंधित है। मछली में आंदोलन की अवधि भी एक महत्वपूर्ण संकेतक है क्योंकि अधिकांश टेलोस्ट प्रजातियों में शुक्राणु 2 मिनट से कम समय तक पूरी तरह से गतिशील रहते हैं और शुक्राणु का प्रक्षेपवक्र आमतौर पर स्तनधारियों15 की तुलना में कम रैखिक होता है। हालांकि, अतीत में शुक्राणु गतिशीलता का आकलन करने वाले कई अध्ययन शुक्राणु15,16 का विश्लेषण करने के व्यक्तिपरक या अर्ध-मात्रात्मक तरीकों पर निर्भर थे। उदाहरण के लिए, मेडाका में शुक्राणु गतिशीलता का अनुमान अतीत में माइक्रोस्कोप17 के तहत नेत्रहीन रूप से लगाया गया है। यह शुक्राणु आंदोलन को रिकॉर्ड करके और फ्रेम को विलय करने और तैराकी पथ और वेग 18,19,20 को मापने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके भी अनुमान लगाया गया है। इस तरह के दृष्टिकोणों में अक्सर मजबूती की कमी होती है, विश्लेषण करने वाले व्यक्ति के अनुसार अलग-अलग परिणाम प्रदान करते हैं15,21।
कंप्यूटर-सहायता प्राप्त शुक्राणु विश्लेषण (CASA) शुरू में स्तनधारियों के लिए विकसित किया गया था। CASA स्वचालित तरीके से वेग और प्रक्षेपवक्र को रिकॉर्ड और मापकर शुक्राणु की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए एक तेज मात्रात्मक विधिहै। मछलियों में, इसका उपयोग विभिन्न प्रजातियों में शुक्राणु की गुणवत्ता पर कई जल प्रदूषकों के प्रभावों की निगरानी के लिए किया गया है, ब्रूडस्टॉक में सुधार के लिए दिलचस्प पूर्वजों की पहचान करने के लिए, क्रायोप्रिजर्वेशन और भंडारण की दक्षता में सुधार करने के लिए, और निषेचन के लिए स्थितियों को अनुकूलित करने केलिए। इसलिए, यह विभिन्न कशेरुक प्रजातियों में शुक्राणु की गुणवत्ता का विश्वसनीय रूप से आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, मछलियों के बीच प्रजनन रणनीतियों में महत्वपूर्ण विविधता के कारण, टेलोस्ट मछली के शुक्राणु स्तनधारियों से और एक मछली प्रजातियों से दूसरे में भिन्न होते हैं। टेलोस्ट मछली, जो मुख्य रूप से पानी में युग्मकों को छोड़कर बाहरी रूप से अंडे को निषेचित करती है, में अत्यधिक केंद्रित शुक्राणु होते हैं जो स्तनधारियों के विपरीत, बिना किसी एक्रोसोम के संरचना में अपेक्षाकृत सरल होते हैं, जो आंतरिक रूप से निषेचित होते हैं और इसलिए पानी में कमजोर पड़ने की भरपाई नहीं करनी पड़ती है, लेकिन अधिक चिपचिपे तरलपदार्थों का सामना करना पड़ता है। इसके अतिरिक्त, अधिकांश मछलियों से शुक्राणु तेजी से चलते हैं लेकिन सक्रियण के बाद 2 मिनट से भी कम समय के लिए पूरी तरह से गतिशील होते हैं, हालांकि कई अपवाद15,22 हैं। क्योंकि अधिकांश मछलियों में गतिशीलता तेजी से कम हो सकती है, मछली के लिए शुक्राणु विश्लेषण प्रोटोकॉल निर्धारित करते समय सक्रियण के बाद विश्लेषण के समय के साथ अत्यधिक देखभाल की जानी चाहिए।
प्रजनन जीव विज्ञान में उन क्षेत्रों में से एक है जिसमें टेलोस्ट और मेडाका को बड़े पैमाने पर मॉडल जीवों के रूप में उपयोग किया गया है। दरअसल, मेडाका पुरुष दिलचस्प प्रजनन और सामाजिक व्यवहार दिखाते हैं, जैसे कि साथी की रखवाली23,24। इसके अलावा, इस प्रजाति25,26,27 में प्रजनन के न्यूरोएंडोक्राइन नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए कई ट्रांसजेनिक लाइनें मौजूद हैं। शुक्राणु नमूनाकरण, एक प्रक्रिया जो बड़ी मछली में अपेक्षाकृत सरल है, छोटी मॉडल मछली में अधिक जटिल हो सकती है क्योंकि वे कम शुक्राणु का उत्पादन करते हैं और अधिक नाजुक होते हैं। इस कारण से, अधिकांश अध्ययनों में 17,28,29,30 विच्छेदित वृषणको कुचलकर मेडाका अर्क मिल्ट (मछली वीर्य) में शुक्राणु के नमूने शामिल हैं। कुछ अध्ययनों में मध्यम18,19,20 को सक्रिय करने में सीधे मिल्ट को व्यक्त करने के लिए एक संशोधित पेट की मालिश का भी उपयोग किया जाता है; हालांकि, इस विधि के साथ निकाले गए मिल्ट की मात्रा और रंग की कल्पना करना मुश्किल है। ज़ेबराफ़िश में, पेट की मालिश का उपयोग आमतौर पर मिल्ट को व्यक्त करने के लिए किया जाता है, जिसे तुरंत एक केशिका ट्यूब 31,32,33 में एकत्र किया जाता है। यह विधि मिल्ट की मात्रा का अनुमान लगाने में सक्षम बनाती है, साथ ही स्खलन रंग का अवलोकन, जो शुक्राणु की गुणवत्ता32,33 का एक त्वरित और सरल संकेतक है। इसलिए, मेडाका के लिए शुक्राणु संग्रह और विश्लेषण के लिए एक स्पष्ट और अच्छी तरह से वर्णित प्रोटोकॉल की कमी है।
इसलिए यह लेख छोटे मॉडल मछली जापानी मेडाका में शुक्राणु संग्रह के दो तरीकों का वर्णन करता है: वृषण विच्छेदन और केशिका ट्यूबों के साथ पेट की मालिश। यह दर्शाता है कि मेडाका के लिए दोनों दृष्टिकोण संभव हैं और दिखाता है कि पेट की मालिश बार-बार की जा सकती है क्योंकि मछली प्रक्रिया से जल्दी से ठीक हो जाती है। यह मेडाका में कंप्यूटर-सहायता प्राप्त शुक्राणु विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन करता है ताकि मेडाका शुक्राणु की गुणवत्ता (गतिशीलता, प्रगति, दीर्घायु और सापेक्ष शुक्राणु एकाग्रता) के कई महत्वपूर्ण संकेतकों को मज़बूती से मापा जा सके। इस उपयोगी छोटे टेलोस्ट मॉडल के लिए निर्दिष्ट ये प्रक्रियाएं, कशेरुक पुरुषों में प्रजनन क्षमता को प्रभावित करने वाले पर्यावरणीय, शारीरिक और आनुवंशिक कारकों की समझ को बहुत बढ़ाएंगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऑस्मोलैलिटी मछली शुक्राणु36,37 के सक्रियण में एक महत्वपूर्ण कारक है। आम तौर पर, शुक्राणु वृषण में इम्मोटाइल होते हैं और मीडिया में गतिशील हो जाते हैं जो समुद्री मछलियों के लिए सेमि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नॉर्वेजियन यूनिवर्सिटी ऑफ लाइफ साइंसेज और यूएस फुलब्राइट कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया है। लेखक मछली सुविधा के रखरखाव के लिए एनएमबीयू में एंथनी पेल्टियर और लॉर्डेस कैरियन जी टैन और इन विधियों का परीक्षण करने के लिए मछली और प्रयोगशाला स्थान प्रदान करने के लिए आईएनआरएई (फ्रांस) में आईएससी एलपीजीपी से गिलाउम गोरमेलिन को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 1.5 mL tubes | Axygen | MCT-150-C | Any standard brand can be used |
| 10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly | Drummond | 2-000-010 | |
| 10x objective with phase contrast | Nikon | MRP90100 | |
| 2 mL tubes | Axygen | MCT-200-c-s | Any standard brand can be used |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Blunt smooth forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Disposable 20 micron counting chamber slide | Microptic | 20.2.25 | Leja 2 chamber slides |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX7 | Any standard brand can be used |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| HBSS | Sigmaaldrich | H8264-1L | |
| Holding sponge | self-made | ||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ts2R | |
| SCA Evolution | Microptic | ||
| Small dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigmaaldrich | S9888 | |
| Tabletop vortex | Labnet | C1301B | |
| Tricaine | Sigmaaldrich | A5040 |
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