JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Et nanobar-støttet lipid dobbeltlagssystem for studier av membrankrumningsfølende proteiner in vitro

Published: November 30, 2022
doi:
10.3791/64340
, ,
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology,Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering,Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science,Nanyang Technological University

Summary

Her er et nanobar-støttet lipid dobbeltlagssystem utviklet for å gi en syntetisk membran med en definert krumning som muliggjør karakterisering av proteiner med krumningsfølerevne in vitro.

Abstract

Membrankrumning spiller viktige roller i ulike essensielle prosesser av celler, for eksempel cellemigrasjon, celledeling og vesikkelhandel. Det genereres ikke bare passivt av cellulære aktiviteter, men regulerer også aktivt proteininteraksjoner og er involvert i mange intracellulære signaleringer. Dermed er det av stor verdi å undersøke rollen som membrankrumning i regulering av fordelingen og dynamikken til proteiner og lipider. Nylig har mange teknikker blitt utviklet for å studere forholdet mellom den buede membranen og protein in vitro. Sammenlignet med tradisjonelle teknikker tilbyr det nyutviklede nanobar-støttede lipid-dobbeltlaget (SLB) både høy gjennomstrømning og bedre nøyaktighet i membrankrumningsgenerering ved å danne et kontinuerlig lipid-dobbeltlag på mønstrede arrays av nanobarer med en forhåndsdefinert membrankrumning og lokal flat kontroll. Både lipidfluiditeten og proteinfølsomheten for buede membraner kan kvantitativt karakteriseres ved hjelp av fluorescensmikroskopiavbildning. Her introduseres en detaljert prosedyre for hvordan man danner en SLB på fabrikkerte glassflater som inneholder nanobararrayer og karakterisering av krumningsfølsomme proteiner på slike SLB. I tillegg dekkes protokoller for gjenbruk av nanobrikker og bildebehandling. Utover nanobar-SLB, er denne protokollen lett anvendelig for alle typer nanostrukturerte glassbrikker for krumningssensorstudier.

Introduction

Membrankrumning er en kritisk fysisk parameter for en celle som forekommer i en rekke cellulære prosesser som morfogenese, celledeling og cellemigrasjon1. Det er allment anerkjent nå at membrankrumning er utenfor et enkelt resultat av cellulære hendelser; I stedet har det dukket opp som en effektiv regulator av proteininteraksjoner og intracellulær signalering. For eksempel ble flere proteiner involvert i clathrin-mediert endocytose funnet å fortrinnsvis binde seg til den buede membranen, noe som resulterte i dannelsen av et hotspot for endocytose2. Det er mange forskjellige årsaker til membrandeformasjon som membrantrekking av cytoskeletale krefter, tilstedeværelsen av lipidasymmetri med forskjellige størrelseshodegrupper, eksistensen av transmembranproteiner med konisk form, akkumulering av membranformende proteiner som BAR-domeneproteiner (oppkalt etter Bin, amfifysin og Rvs-proteiner) og innsetting av amfipatiske helices-domenet i membranen1 . Interessant nok deformerer disse proteinene og lipidene ikke bare membranen, men kan også fornemme membrankrumningen og utvise fortrinnsrettakkumulering 1. Derfor er det avgjørende å studere om og hvordan membraner med forskjellige krumninger endrer fordelingen og dynamikken til proteiner og lipider festet til dem og de potensielle effektene på de relaterte intracellulære prosessene.

Mange teknikker er utviklet for å analysere samspillet mellom buet membran og proteiner i både levende celler og in vitro-systemer. Det levende cellesystemet gir et ekte cellemiljø med rikt lipiddiversitet og dynamisk proteinsignalregulering 2,3,4,5,6,7. Et slikt sofistikert system er imidlertid vanskelig å studere på grunn av usikkerhetene og svingningene i det intracellulære miljøet. Derfor har in vitro-analysene ved bruk av en kunstig membran sammensatt av kjente lipidarter og rensede proteiner blitt kraftige rekonstitueringssystemer for å karakterisere forholdet mellom proteiner og buede membraner. Tradisjonelt genereres liposomer med forskjellige diametre ved ekstrudering for å oppdage krumningsfølsomme proteiner via enten en ko-sedimenteringsanalyse ved bruk av sentrifugalkraft eller en samflotasjonsanalyse med en tetthetsgradient for å unngå proteinaggregering 8,9. Krumningen til de ekstruderte liposomene er imidlertid begrenset av den tilgjengelige porestørrelsen til membranfilteret som brukes i ekstruderen10. Enkelt liposomkurvatur (SLiC) -analyse har vist seg å overvinne denne begrensningen, der liposomer med forskjellige diametre er fluorescensmerket og immobilisert på overflaten slik at krumningen kan markeres med fluorescerende intensitet11. Imidlertid er det observert sterk variasjon i lipidsammensetningen i små vesikler, noe som påvirker nøyaktigheten av krumningsmålingen12. Tether-pulling eksperimenter gir en mer nøyaktig måling av krumningen på den forbigående tether trukket fra gigantiske unilamellar vesikler (GUVs) ved hjelp av en optisk pinsett, hvor krumningen kan styres godt av membranspenningen generert13,14. Denne metoden er egnet til å studere enten positive eller negative krumningsfølende proteiner, men er begrenset av gjennomstrømningen av rørgenerering10. Støttede membranrør (SMrT) -analyse gir samtidig generering av flere membranrør som ekstruderes fra samme lipidreservoar ved mikrofluidiske strømmer. Likevel varierer membrankrumningen iboende langs nanorøret, noe som kompromitterer nøyaktigheten av fluorescensintensitetsbasert krumningsmåling15,16. Til sammenligning genererte bruk av små unilamellære vesikler (SUVer, diameter <100 nm17) for å danne et støttet lipid dobbeltlag (SLB) på overflater som inneholder designede topografier en enkelt dobbeltlagsmembran med krumninger forhåndsbestemt av nanofabrikasjon eller nanomaterialer med høy nøyaktighet18,19,20.

Her presenterer vi en protokoll for dannelsen av SLB på fabrikkerte nanochipflater med nanobararrayer og hvordan den kan brukes til å undersøke krumningsfølsomheten til proteiner in vitro. Som vist i figur 1, er det seks viktige komponenter i analysen: A) Rengjøring og montering av brikken med et mikrofluidisk kammer; B) Fremstilling av SUVer med definert lipidsammensetning; C) Dannelse av SLB på en nanochip og binding med krumningsfølsomme proteiner; D) Avbildning og karakterisering av SLB og krumningsfølsomme proteiner under fluorescensmikroskopi; E) Rengjøring av brikken for gjenbruk; F) Bildebehandling for kvantitativ analyse av proteinkrumningssensorevne. Den detaljerte protokollen er beskrevet trinn for trinn nedenfor.

Protocol

1. Rengjøring av nanochip Plasser nanobrikken i et 10 ml beger med den mønstrede siden vendt opp.MERK: Denne kvarts nanochip har blitt produsert via elektronstrålelitografi som beskrevet før21. Geometrien og arrangementet av nanostrukturen på brikken kan tilpasses. Størrelsene på gradient nanobarer som brukes her er 2000 nm i lengde, 600 nm i høyde og 100 til 1000 nm i bredde (100 nm trinnsett). Tilsett forsiktig 1 ml 98% svovelsyre til beg…

Representative Results

Nanobardesign anbefales for sondering av positive krumningsfølende proteiner, som inneholder en halvsirkel i hver ende med krumning definert av nanobarbredden og en flat/null krumningskontroll lokalt i midten (figur 2A, B). Vellykket dannelse av SLB på nanobarer resulterer i jevnt fordelte lipidmarkørsignaler over hele nanobaroverflaten som vist i figur 2C. Signaler fra flere nanobarer kan kombineres ved å beregne gjennomsnittet av de enkelt…

Discussion

Nanobar-SLB-systemet beskrevet her tilbyr en unik kombinasjon av fordelene i flere eksisterende in vitro-analyser. Det avslører effektivt den foretrukne bindingen av proteiner til høyt buede membraner som liposomflytning eller sedimenteringsanalyse, men krever mye færre prøver og gir mer nøyaktig definert krumning på individuelle nanobarer 8,29. Det tilbyr også et bredt spekter av nøyaktig kontrollert krumning for samtidig sammenligning som SLiC-…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) og Senter for forstyrrende fotoniske teknologier (CDPT) ved Nanyang Technological University (NTU) for å støtte nanostrukturfabrikasjon og SEM-avbildning, Protein Production Platform (PPP) ved School of Biological Sciences NTU for proteinrensing, og School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for konfokalmikroskopet. Dette arbeidet er finansiert av Singapore Ministry of Education (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 og MOE-T2EP30220-0009), Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) støttet av MOE-finansiering under Research Centres of Excellence-ordningen (W. Zhao), Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for forskningsstipendet (X. Miao), og China Scholarship Council for forskningsstipendet (J. Wu).

Materials

Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

Tags

Keywords: Nanobar-supported Lipid BilayerMembrane Curvature SensingProtein DynamicsNanofabricationPiranha SolutionLipid MixtureSUVsPDMS Chamber
check_url/64340?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image