Yüksek verimli izolasyon ve küçük hücre dışı veziküllerin saflaştırılması için akış sitometrik sıralama parametrelerinin optimizasyonu
Summary
Bu protokol, hava püskürtme nozulunun boyutunu, kılıf sıvısı basıncını, numune akış basıncını, voltajı, kazancı ve tetikleyici eşik parametrelerini optimize ederek küçük hücre dışı veziküller için hızlı ve boyuta özgü bir izolasyon yöntemi sağlar.
Abstract
Küçük hücre dışı veziküller (sEV) tüm hücre tiplerinden salınabilir ve protein, DNA ve RNA taşıyabilir. Sinyal molekülleri, bir hücrenin fizyolojik ve patolojik durumunun göstergeleri olarak hizmet eder. Bununla birlikte, aşağı akış biyobelirteci tanımlamasını ve ilaç müdahale çalışmalarını önleyen sEV izolasyonu için standart bir yöntem yoktur. Bu yazıda, bir akış hücresi sıralayıcısı ile 50-200 nm sEV’nin izolasyonu ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bunun için, iyi bir sıralama hızı ve kararlı bir yan akış elde etmek için 50 μm’lik bir nozul ve 80 psi kılıf sıvı basıncı seçildi. Standart boyutlu polistiren mikrosferler, 100, 200 ve 300 nm parçacıkların popülasyonlarını bulmak için kullanıldı. Voltaj, kazanç ve ileri saçılma (FSC) tetikleme eşiğinin ek optimizasyonu ile sEV sinyali arka plan gürültüsünden ayrılabilir. Bu optimizasyonlar, yalnızca FSC ve yan saçılma (SSC) kullanarak temsili bir sEV popülasyonu elde edilmesini sağlayan kritik sıralama ayarlarından oluşan bir panel sağlar. Akış sitometrisi tabanlı izolasyon yöntemi sadece yüksek verimli analize izin vermekle kalmaz, aynı zamanda biyobelirteç ekspresyonuna dayalı sEV’nin senkron sınıflandırmasına veya proteom analizine izin vererek çok sayıda aşağı akış araştırma uygulaması açar.
Introduction
Bir hücre, hücreler arası iletişim için önemli olan sinyal molekülleri ve membran kapanımları ile sonuçlanan çeşitli boyutlarda hücre dışı vezikülleri (EV’ler) serbest bırakır1. Farklı boyutlardaki EV’ler de farklı biyolojik roller oynar, 50-200 nm sEV, RNA, DNA ve proteinleri doğru hücre dışı konuma hassas bir şekilde dağıtabilir. sEV ayrıca, sadece immün sürveyans, kök hücre bakımı, kan pıhtılaşması ve doku onarımı gibi normal fizyolojik süreçlerin düzenlenmesini değil, aynı zamanda tümör ilerlemesi ve metastaz 2,3 gibi çeşitli hastalıkların altında yatan patolojiyi de içeren salgı mekanizmalarını belirlemeye yardımcı olur. sEV’nin etkili izolasyonu ve analizi, biyobelirteçlerin tanımlanması ve gelecekteki ilaç müdahalelerinin tasarlanması için kritik öneme sahiptir.
sEV’nin klinik uygulaması üzerine yapılan sürekli araştırmalarla, sEV’nin izolasyon yöntemleri daha yüksek gereksinimler ortaya koymuştur. sEV’nin boyut, kaynak ve içerik bakımından heterojenliğinin yanı sıra fizikokimyasal ve biyokimyasal özelliklerde diğer EV’lerle benzerliği nedeniyle, sEV izolasyonu 4,5 için standart bir yöntem yoktur. Şu anda, ultrasantrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi (SEC), polimer çökeltme ve immünoaffinite yakalama en yaygın sEV izolasyon yöntemleridir6. Ultra santrifüjleme, zaman alıcı olmasına rağmen, araştırmada sEV izolasyonu için hala altın standarttır, bu da 40-500 nm’lik geniş bir boyut dağılımı ile düşük saflığa ve uzun süreli santrifüjlemeden sonra sEV’ye önemli mekanik hasara neden olur 7,8,9. Genellikle polietilen glikol (PEG) kullanan polimer çökeltmesi, hücre dışı protein agregalarının eşzamanlı çökelmesi ve polimer kontaminasyonu10,11 ile sonraki fonksiyonel analizler için kabul edilemez saflıktan muzdariptir. İmmünoaffinite yakalama tabanlı yöntemler, farklı özgüllüklere sahip yüksek maliyetli antikorlar gerektirir, ayrıca düşük işlem hacmi ve verim12,13,14 ile ilgili problemleri vardır. Partikül boyutu, izole edilmiş sEV’nin saflığını değerlendirmek için ana göstergelerden biridir. Her ne kadar sEV saflığı ulaşılamaz bir hedef olmaya devam etse de, SEC önemli miktarda orta bileşeni ortadan kaldırır ve SEC yöntemiyle ekstrakte edilen sEV parçacıkları esas olarak 50-200 nm15 aralığındadır. Mevcut tekniklerin zaman alıcı, düşük saflık, düşük verim, zayıf tekrarlanabilirlik, düşük numune verimi ve sEV’nin potansiyel hasarı dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birkaç dezavantajı vardır, bu da onu klinik kullanımla uyumsuz hale getirir16. Bu nedenle, çeşitli biyosıvılara uygulanabilir hızlı, ucuz ve boyut olarak belirlenmiş bir sEV izolasyon yöntemi, çeşitli araştırma ve klinik durumlarda önemli bir ihtiyaçtır.
Akış sitometrisinde, tek parçacıklar yüksek verimli, multiparametrik bir şekilde analiz edilir ve alt kümeler17’ye ayrılır. EV’lerin heterojenliği nedeniyle, hücre analizi paradigmalarını takip eden EV’leri araştırmak için kullanılan tek parçacıklı bir akış sitometrik ölçümü ideal olacaktır, fizyoloji ile ilgili özellikleri ve protein bileşenlerini tanımlamak için ışık saçılımı ve floresan etiketleri kullanılmaktadır18,19,20. Bununla birlikte, geleneksel akış sitometrisi, küçük boyutlu sEV’ler ve düşük yüzey biyobelirteçleri bolluğu ile zorlanmaktadır. Akış sitometrisinin hassasiyeti, ileri saçılma (FSC), yan saçılma (SSC) veya floresan eşiği tetikleyici parametre19 kullanılmasına bakılmaksızın arka plan gürültüsünü ve sEV’yi ayırt etmek için algılama parametrelerini optimize ederek geliştirilebilir.
Mevcut protokolle, yüksek çözünürlüklü akış sitometrik sıralama ayarları, standart olarak floresan boncuklar kullanılarak optimize edildi. Uygun nozul boyutunu, kılıf sıvısı basıncını, eşik tetikleme parametresini ve dağınık ışık yoğunluklarını kontrol eden voltajları seçerek, sEV’nin belirli bir alt kümesini karmaşık bir karışımdan izole edebildik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, NTA tarafından doğrulanan bir akış hücresi sıralayıcısı kullanarak 50-200 nm’lik belirtilen parçacık boyutuyla sEV’yi izole etmek ve saflaştırmak için optimize edilmiş bir yöntemi özetlemektedir. Yöntem, düzgün parçacık boyutu ve yüksek saflıkta sEV elde etme darboğazı problemini çözdü ve büyük boyutlu EV’lere sarılmış ilgisiz biyolojik moleküllerin müdahalesini önledi22. Saniyede 100.000 parçacık yakalayabilen ve saniyede 70.000 sıralama karar?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Zhejiang Çin Tıbbı Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonu (2020ZG29), Zhejiang Eyaleti Temel Kamu Refahı Araştırma Projesi (LGF19H150006, LTGY23B070001), Zhejiang İl Eğitim Bakanlığı Projesi (Y202147028) ve Zhejiang Üniversitesi Laboratuvar Bölümü Deneysel Teknoloji Projesi (SJS201712, SYB202130) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
