Praktische problemen aanpakken bij op atoomkrachtmicroscopie gebaseerde micro-inkeping op menselijke gewrichtskraakbeenexplantaten

Summary

We presenteren een stapsgewijze aanpak om de meest voorkomende problemen in verband met micro-inkepingen met atoomkrachtmicroscopie te identificeren en aan te pakken. We illustreren de opkomende problemen bij inheemse menselijke gewrichtskraakbeenexplantaten die worden gekenmerkt door verschillende gradaties van door artrose veroorzaakte degeneratie.

Abstract

Zonder twijfel is atoomkrachtmicroscopie (AFM) momenteel een van de krachtigste en nuttigste technieken om micro- en zelfs nanosignalen op biologisch gebied te beoordelen. Zoals bij elke andere microscopische benadering kunnen er echter methodologische uitdagingen ontstaan. Met name de kenmerken van het monster, de monstervoorbereiding, het type instrument en de indruksonde kunnen leiden tot ongewenste artefacten. In dit protocol illustreren we deze opkomende problemen met zowel gezonde als osteoartritische gewrichtskraakbeenexplantaten. Daartoe laten we eerst via een stapsgewijze aanpak zien hoe ex vivo gewrichtskraakbeenschijven kunnen worden gegenereerd, beoordeeld en visueel geclassificeerd volgens verschillende stadia van degeneratie door middel van grote 2D-mozaïekfluorescentiebeeldvorming van de explantaten van het hele weefsel. De belangrijkste kracht van het ex vivo-model is dat het verouderd, inheems, menselijk kraakbeen bevat dat het mogelijk maakt om artrose-gerelateerde veranderingen van vroeg begin tot progressie te onderzoeken. Daarnaast worden ook veelvoorkomende valkuilen bij weefselpreparatie gepresenteerd, evenals de eigenlijke AFM-procedure samen met de daaropvolgende data-analyse. We laten zien hoe basale maar cruciale stappen zoals monstervoorbereiding en -verwerking, topografische monsterkenmerken veroorzaakt door geavanceerde degeneratie en interactie tussen monster en tip van invloed kunnen zijn op het verzamelen van gegevens. Ook nemen we de meest voorkomende problemen in de AFM onder de loep en beschrijven we, waar mogelijk, hoe deze kunnen worden opgelost. Kennis van deze beperkingen is van het grootste belang voor het correct verzamelen, interpreteren en uiteindelijk inbedden van bevindingen in een brede wetenschappelijke context.

Introduction

Door de steeds kleiner wordende omvang van elektronische apparaten en systemen is de snelle ontwikkeling van micro- en nanogebaseerde technologie en apparatuur in een stroomversnelling geraakt. Een van die apparaten is atoomkrachtmicroscopie (AFM), die biologische oppervlakken kan scannen en topografische of biomechanische informatie kan ophalen op zowel nano- als micrometerschaal ^1,2. Een van de enorme functies is dat deze tool kan worden gebruikt als een micro- en een nano-indenter om informatie te verkrijgen over de mechanische eigenschappen van verschillende biologische systemen 3,4,5,6. De gegevens worden verzameld door fysiek contact met het oppervlak via een mechanische sonde, die zo klein kan zijn als ongeveer 1 nm aan het uiteinde⁷. De resulterende vervorming van het monster wordt vervolgens weergegeven op basis van de indrukdiepte van de uitkragende punt en de kracht die op het monster^{wordt uitgeoefend 8}.

Artrose (OA) is een langdurige degeneratieve chronische ziekte die wordt gekenmerkt door verslechtering van het gewrichtskraakbeen in de gewrichten en omliggende weefsels, wat kan leiden tot volledige blootstelling van de botoppervlakken. De last van artrose is aanzienlijk; Momenteel lijdt de helft van alle vrouwen en een derde van alle mannen van 65 jaar en ouder aan artrose⁹. Trauma’s, obesitas en de daaruit voortvloeiende veranderde biomechanica van het gewricht¹⁰ bepalen de gewrichtskraakbeendegeneratie, die wordt gezien als een gemeenschappelijk eindresultaat. De baanbrekende studie van Ganz et al. stelde dat de vroege stappen van het artroseproces de biomechanische eigenschappen van kraakbeen¹¹ kunnen omvatten, en sindsdien hebben onderzoekers deze hypothese bevestigd¹². Evenzo wordt algemeen aanvaard dat de biomechanische eigenschappen van het weefsel functioneel worden georkestreerd door de ultrastructurele organisatie en door overspraak tussen cellen en celmatrixen. Elke verandering kan een dramatische invloed hebben op het algehele biomechanische functioneren van het weefsel¹³. Tot op heden is de diagnose van artrose klinisch en gebaseerd op gewone filmradiografie¹⁴. Deze benadering is tweezijdig: ten eerste maakt het ontbreken van een gedefinieerde degeneratieve afkapdrempel om de diagnose artrose te formuleren de aandoening moeilijk te kwantificeren, en ten tweede missen beeldvormingsmethoden gevoeligheid en standaardisatie en kunnen ze geen gelokaliseerde kraakbeenschade detecteren^15,16,17. Daartoe heeft de beoordeling van de mechanische eigenschappen van het kraakbeen het doorslaggevende voordeel dat het een parameter beschrijft die in de loop van artrose verandert, ongeacht de etiologie van de ziekte, en die in een zeer vroeg stadium een directe invloed heeft op de weefselfunctionaliteit. Indrukkingsinstrumenten meten de kracht waarmee het weefsel zich tegen de indrukking verzet. Dit is in feite geen nieuw concept; De vroegste studies dateren uit de jaren 1980 en 1990. In deze periode suggereerden talrijke studies dat indrukkingsinstrumenten die zijn ontworpen voor de arthroscopische metingen van gewrichtskraakbeen zeer geschikt zouden kunnen zijn om degeneratieve veranderingen in het kraakbeen te detecteren. Zelfs 30 jaar geleden konden sommige onderzoeken aantonen dat indrukkingsinstrumenten in vivo veranderingen in het kraakbeenoppervlak tijdens weefseldegeneratie konden detecteren door drukstijfheidsmetingen uit te voeren tijdens artroscopie^18,19,20.

AFM-inkeping (AFM-IT) van het gewrichtskraakbeen geeft informatie over een cruciale mechanische eigenschap van het weefsel, namelijk stijfheid. Dit is een mechanische parameter die de relatie beschrijft tussen een toegepaste, niet-destructieve belasting en de resulterende vervorming van het ingesprongen weefselgebied²¹. AFM-IT is in staat gebleken om leeftijdsafhankelijke veranderingen in stijfheid in macroscopisch onaangetaste collageennetwerken te kwantificeren, waardoor onderscheid wordt gemaakt tussen de pathologische veranderingen die verband houden met het begin van artrose (graad 0 op de Outerbridge-schaal in gewrichtskraakbeen)²². We hebben eerder aangetoond dat AFM-IT’s, op basis van ruimtelijke chondrocytenorganisatie als een op beelden gebaseerde biomarker voor vroege kraakbeendegeneratie, niet alleen de vroegste degeneratieve mechanische veranderingen kunnen kwantificeren, maar ook daadwerkelijk kunnen lokaliseren. Deze bevindingen zijn al bevestigd door anderen^23,24. Daarom fungeert AFM-IT als een interessant instrument om vroege degeneratieve veranderingen te diagnosticeren en te identificeren. Deze veranderingen kunnen al op cellulair niveau worden gemeten, waardoor het begrip van het pathofysiologische proces van artrose opnieuw wordt vormgegeven.

In dit protocol demonstreren we een volledige histologische en biomechanische beoordelingsprocedure van gewrichtskraakbeenexplantaten, van de voorbereiding van het inheemse kraakbeenexplantatie tot AFM-gegevensverzameling en -verwerking. Door middel van een stap-voor-stap aanpak, laten we zien hoe het articulair kraakbeenweefsel volgens verschillende stadia van degeneratie kan worden gegenereerd, gesorteerd en visueel geclassificeerd door middel van 2D grote mozaïekbeeldvorming, gevolgd door micro-AFM inkepingen.

Hoewel AFM-IT momenteel een van de meest gevoelige instrumenten is om biomechanische veranderingen in kraakbeen te meten⁷, heeft het, net als elke andere instrumentele techniek, beperkingen en praktische eigenaardigheden²⁵ die kunnen leiden tot foutieve gegevensverzameling. Daartoe onderwerpen we de meest voorkomende problemen die zich voordoen tijdens AFM-metingen van de kraakbeenexplantaten en beschrijven we, waar mogelijk, hoe deze te minimaliseren of te overwinnen. Deze omvatten topografische aspecten van de steekproeven en de moeilijkheden om hen in een AFM-compatibele omgeving te stabiliseren, fysieke eigenaardigheden van het oppervlak van het weefsel, en de daaruit voortvloeiende moeilijkheden bij het uitvoeren van AFM-metingen op dergelijke oppervlakten. Er worden ook voorbeelden gegeven van foutieve kracht-afstandscurves, waarbij de nadruk wordt gelegd op de omstandigheden die deze kunnen veroorzaken. Bijkomende beperkingen die inherent zijn aan de geometrie van de cantilevertip en het gebruik van het Hertz-model voor de data-analyse worden ook besproken.

Protocol

Er werden femurcondylen gebruikt die waren verzameld bij patiënten die een totale knieartroplastiek ondergingen in het Universitair Ziekenhuis van Tübingen, Duitsland. Alleen gewrichtskraakbeenmonsters van patiënten met degeneratieve en posttraumatische gewrichtspathologieën werden in deze studie opgenomen. Vóór de start van het onderzoek werd goedkeuring verkregen van departementale, institutionele en lokale ethische commissies (projectnr. 674/2016BO2). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd ontvangen van a…

Representative Results

Met behulp van een zelfgemaakt snijapparaat waren we in staat om kleine (4 mm x 1 mm) kraakbeenschijven te explanteren en te genereren uit verse menselijke condylen met een enkel cellulair ruimtelijk patroon30 van enkele snaren (SS, Figuur 2A), dubbele snaren (DS), kleine clusters (SC), grote clusters (BC; Figuur 2A) en diffuus (Figuur 2B). Een representatieve kraakbeenexplantatie is afgebeeld in <strong clas…

Discussion

Als progressieve en multifactoriële ziekte veroorzaakt artrose structurele en functionele veranderingen in het gewrichtskraakbeen. In de loop van artrose gaan stoornissen in mechanische kenmerken gepaard met structurele en biochemische veranderingen aan het oppervlak van het gewrichtskraakbeen^27,31. De vroegste pathologische gebeurtenissen die optreden bij artrose zijn proteoglycaandepletie in combinatie met verstoring van het collageennetwerk^3…

Materials

Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium