We presenteren een stapsgewijze aanpak om de meest voorkomende problemen in verband met micro-inkepingen met atoomkrachtmicroscopie te identificeren en aan te pakken. We illustreren de opkomende problemen bij inheemse menselijke gewrichtskraakbeenexplantaten die worden gekenmerkt door verschillende gradaties van door artrose veroorzaakte degeneratie.
Zonder twijfel is atoomkrachtmicroscopie (AFM) momenteel een van de krachtigste en nuttigste technieken om micro- en zelfs nanosignalen op biologisch gebied te beoordelen. Zoals bij elke andere microscopische benadering kunnen er echter methodologische uitdagingen ontstaan. Met name de kenmerken van het monster, de monstervoorbereiding, het type instrument en de indruksonde kunnen leiden tot ongewenste artefacten. In dit protocol illustreren we deze opkomende problemen met zowel gezonde als osteoartritische gewrichtskraakbeenexplantaten. Daartoe laten we eerst via een stapsgewijze aanpak zien hoe ex vivo gewrichtskraakbeenschijven kunnen worden gegenereerd, beoordeeld en visueel geclassificeerd volgens verschillende stadia van degeneratie door middel van grote 2D-mozaïekfluorescentiebeeldvorming van de explantaten van het hele weefsel. De belangrijkste kracht van het ex vivo-model is dat het verouderd, inheems, menselijk kraakbeen bevat dat het mogelijk maakt om artrose-gerelateerde veranderingen van vroeg begin tot progressie te onderzoeken. Daarnaast worden ook veelvoorkomende valkuilen bij weefselpreparatie gepresenteerd, evenals de eigenlijke AFM-procedure samen met de daaropvolgende data-analyse. We laten zien hoe basale maar cruciale stappen zoals monstervoorbereiding en -verwerking, topografische monsterkenmerken veroorzaakt door geavanceerde degeneratie en interactie tussen monster en tip van invloed kunnen zijn op het verzamelen van gegevens. Ook nemen we de meest voorkomende problemen in de AFM onder de loep en beschrijven we, waar mogelijk, hoe deze kunnen worden opgelost. Kennis van deze beperkingen is van het grootste belang voor het correct verzamelen, interpreteren en uiteindelijk inbedden van bevindingen in een brede wetenschappelijke context.
Door de steeds kleiner wordende omvang van elektronische apparaten en systemen is de snelle ontwikkeling van micro- en nanogebaseerde technologie en apparatuur in een stroomversnelling geraakt. Een van die apparaten is atoomkrachtmicroscopie (AFM), die biologische oppervlakken kan scannen en topografische of biomechanische informatie kan ophalen op zowel nano- als micrometerschaal 1,2. Een van de enorme functies is dat deze tool kan worden gebruikt als een micro- en een nano-indenter om informatie te verkrijgen over de mechanische eigenschappen van verschillende biologische systemen 3,4,5,6. De gegevens worden verzameld door fysiek contact met het oppervlak via een mechanische sonde, die zo klein kan zijn als ongeveer 1 nm aan het uiteinde7. De resulterende vervorming van het monster wordt vervolgens weergegeven op basis van de indrukdiepte van de uitkragende punt en de kracht die op het monsterwordt uitgeoefend 8.
Artrose (OA) is een langdurige degeneratieve chronische ziekte die wordt gekenmerkt door verslechtering van het gewrichtskraakbeen in de gewrichten en omliggende weefsels, wat kan leiden tot volledige blootstelling van de botoppervlakken. De last van artrose is aanzienlijk; Momenteel lijdt de helft van alle vrouwen en een derde van alle mannen van 65 jaar en ouder aan artrose9. Trauma’s, obesitas en de daaruit voortvloeiende veranderde biomechanica van het gewricht10 bepalen de gewrichtskraakbeendegeneratie, die wordt gezien als een gemeenschappelijk eindresultaat. De baanbrekende studie van Ganz et al. stelde dat de vroege stappen van het artroseproces de biomechanische eigenschappen van kraakbeen11 kunnen omvatten, en sindsdien hebben onderzoekers deze hypothese bevestigd12. Evenzo wordt algemeen aanvaard dat de biomechanische eigenschappen van het weefsel functioneel worden georkestreerd door de ultrastructurele organisatie en door overspraak tussen cellen en celmatrixen. Elke verandering kan een dramatische invloed hebben op het algehele biomechanische functioneren van het weefsel13. Tot op heden is de diagnose van artrose klinisch en gebaseerd op gewone filmradiografie14. Deze benadering is tweezijdig: ten eerste maakt het ontbreken van een gedefinieerde degeneratieve afkapdrempel om de diagnose artrose te formuleren de aandoening moeilijk te kwantificeren, en ten tweede missen beeldvormingsmethoden gevoeligheid en standaardisatie en kunnen ze geen gelokaliseerde kraakbeenschade detecteren15,16,17. Daartoe heeft de beoordeling van de mechanische eigenschappen van het kraakbeen het doorslaggevende voordeel dat het een parameter beschrijft die in de loop van artrose verandert, ongeacht de etiologie van de ziekte, en die in een zeer vroeg stadium een directe invloed heeft op de weefselfunctionaliteit. Indrukkingsinstrumenten meten de kracht waarmee het weefsel zich tegen de indrukking verzet. Dit is in feite geen nieuw concept; De vroegste studies dateren uit de jaren 1980 en 1990. In deze periode suggereerden talrijke studies dat indrukkingsinstrumenten die zijn ontworpen voor de arthroscopische metingen van gewrichtskraakbeen zeer geschikt zouden kunnen zijn om degeneratieve veranderingen in het kraakbeen te detecteren. Zelfs 30 jaar geleden konden sommige onderzoeken aantonen dat indrukkingsinstrumenten in vivo veranderingen in het kraakbeenoppervlak tijdens weefseldegeneratie konden detecteren door drukstijfheidsmetingen uit te voeren tijdens artroscopie18,19,20.
AFM-inkeping (AFM-IT) van het gewrichtskraakbeen geeft informatie over een cruciale mechanische eigenschap van het weefsel, namelijk stijfheid. Dit is een mechanische parameter die de relatie beschrijft tussen een toegepaste, niet-destructieve belasting en de resulterende vervorming van het ingesprongen weefselgebied21. AFM-IT is in staat gebleken om leeftijdsafhankelijke veranderingen in stijfheid in macroscopisch onaangetaste collageennetwerken te kwantificeren, waardoor onderscheid wordt gemaakt tussen de pathologische veranderingen die verband houden met het begin van artrose (graad 0 op de Outerbridge-schaal in gewrichtskraakbeen)22. We hebben eerder aangetoond dat AFM-IT’s, op basis van ruimtelijke chondrocytenorganisatie als een op beelden gebaseerde biomarker voor vroege kraakbeendegeneratie, niet alleen de vroegste degeneratieve mechanische veranderingen kunnen kwantificeren, maar ook daadwerkelijk kunnen lokaliseren. Deze bevindingen zijn al bevestigd door anderen23,24. Daarom fungeert AFM-IT als een interessant instrument om vroege degeneratieve veranderingen te diagnosticeren en te identificeren. Deze veranderingen kunnen al op cellulair niveau worden gemeten, waardoor het begrip van het pathofysiologische proces van artrose opnieuw wordt vormgegeven.
In dit protocol demonstreren we een volledige histologische en biomechanische beoordelingsprocedure van gewrichtskraakbeenexplantaten, van de voorbereiding van het inheemse kraakbeenexplantatie tot AFM-gegevensverzameling en -verwerking. Door middel van een stap-voor-stap aanpak, laten we zien hoe het articulair kraakbeenweefsel volgens verschillende stadia van degeneratie kan worden gegenereerd, gesorteerd en visueel geclassificeerd door middel van 2D grote mozaïekbeeldvorming, gevolgd door micro-AFM inkepingen.
Hoewel AFM-IT momenteel een van de meest gevoelige instrumenten is om biomechanische veranderingen in kraakbeen te meten7, heeft het, net als elke andere instrumentele techniek, beperkingen en praktische eigenaardigheden25 die kunnen leiden tot foutieve gegevensverzameling. Daartoe onderwerpen we de meest voorkomende problemen die zich voordoen tijdens AFM-metingen van de kraakbeenexplantaten en beschrijven we, waar mogelijk, hoe deze te minimaliseren of te overwinnen. Deze omvatten topografische aspecten van de steekproeven en de moeilijkheden om hen in een AFM-compatibele omgeving te stabiliseren, fysieke eigenaardigheden van het oppervlak van het weefsel, en de daaruit voortvloeiende moeilijkheden bij het uitvoeren van AFM-metingen op dergelijke oppervlakten. Er worden ook voorbeelden gegeven van foutieve kracht-afstandscurves, waarbij de nadruk wordt gelegd op de omstandigheden die deze kunnen veroorzaken. Bijkomende beperkingen die inherent zijn aan de geometrie van de cantilevertip en het gebruik van het Hertz-model voor de data-analyse worden ook besproken.
Als progressieve en multifactoriële ziekte veroorzaakt artrose structurele en functionele veranderingen in het gewrichtskraakbeen. In de loop van artrose gaan stoornissen in mechanische kenmerken gepaard met structurele en biochemische veranderingen aan het oppervlak van het gewrichtskraakbeen27,31. De vroegste pathologische gebeurtenissen die optreden bij artrose zijn proteoglycaandepletie in combinatie met verstoring van het collageennetwerk3…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de orthopedisch chirurgen van de afdeling Orthopedische Chirurgie van het Universitair Ziekenhuis van Tübingen voor het ter beschikking stellen van de weefselmonsters.
Amphotericin B | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1397-89-3 | |
Atomic force microscop (AFM) head | CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | JPK00518 | |
Biocompatible sample glue | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | H000033 | |
Calcein AM | Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA | 14948 | Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging |
Cantilever | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SAA-SPH-5UM | Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm, geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius |
Cartilage ctting device | Self-made | n/a | Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm |
CDD camera integrated in the AFM | The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany | DFK 31BF03 | |
CDD camera integrated in the fluorescence microscope | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DFC3000G | |
Cryotome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | CM3050S | |
Data Processing Software for the AFM | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Version 5.0.86, can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | 11889113 | |
Glass block cantiliver holder | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SP-90-05 | Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker). |
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F1315 | |
Microscope glass slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS294775X50 | |
Mounting medium With DAPI | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 50011 | Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs side view imaging |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4333 | |
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
Scalpel | Feather Medical Products, Osaka, Japan | 2023-01 | |
Silicone Skirt | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent medium condensation in the AFM head. |
Statistical program – SPSS | IBM, Armonk, New York, USA | SPSS Statistics 22 | Vesion 280.0.0.0 (190) |
Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 | Water-soluble embedding medium |