מקור ומסלול של זיהום אלקלואיד Pyrrolizidine בדגימות תה
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הזיהום של אלקלואידים פירוליזידין (PAs) בדגימות תה מעשבים המייצרים עשבים בשטחי הרשות הפלסטינית בגינות תה.
Abstract
אלקלואידים פירוליזידין רעילים (PAs) נמצאים בדגימות תה, אשר מהווים איום על בריאות האדם. עם זאת, המקור והתוואי של זיהום הרשות הפלסטינית בדגימות תה נותרו לא ברורים. בעבודה זו, פותחה שיטת ספיגה בשילוב עם UPLC-MS/MS כדי לקבוע 15 PAs בעשב Ageratum conyzoides L., A. conyzoides קרקע ריזוספרית, עלי תה טריים, ודגימות תה מיובש. ממוצע המחלימים נע בין 78%-111%, עם סטיות תקן יחסיות של 0.33%-14.8%. חמישה עשר זוגות של דגימות קרקע ריזוספריות של A. conyzoides ו-A. conyzoides ו-60 דגימות עלי תה טריים נאספו מגן התה Jinzhai בפרובינציית אנחווי, סין, ונותחו עבור 15 PAs. לא כל 15 ה-PAs התגלו בעלי תה טריים, למעט תחמוצת N (ImNO) וסנציונין (Sn). התוכן של ImNO (34.7 מיקרוגרם / ק”ג) היה גדול מזה של Sn (9.69 מיקרוגרם / ק”ג). בנוסף, הן ImNO והן Sn היו מרוכזים בעלים הצעירים של צמח התה, בעוד התוכן שלהם היה נמוך יותר בעלים הישנים. התוצאות הצביעו על כך שהרש”פ בתה הועברו דרך הדרך של עשבים שוטים המייצרים עשבים שוטים – אדמה – עלי תה טריים בגינות תה.
Introduction
כמטבוליטים משניים, אלקלואידים פירוליזידין (PAs) מגנים על צמחים מפני אוכלי עשב, חרקים ופתוגנים 1,2. עד כה, מעל 660 PAs ותחמוצות PA-N (PANOs) עם מבנים שונים נמצאו ביותר מ -6,000 מיני צמחים ברחבי העולם 3,4. צמחים המייצרים PA נמצאים בעיקר במשפחות מורכבים, Boraginaceae, Fabaceae ו- Apocynaceae 5,6. PAs מחומצנים בקלות לאלקלואידים לא יציבים של דהידרופירוליזידין, שיש להם אלקטרופיליות חזקה ויכולים לתקוף נוקלאופילים כגון DNA וחלבונים, וכתוצאה מכך נמק של תאי כבד, חסימות ורידיות, שחמת, מיימת ותסמינים אחרים 7,8. איבר המטרה העיקרי של רעילות הרשות הפלסטינית הוא הכבד. PAs יכולים גם לגרום לרעילות ריאות, כליות ואיברים אחרים ולרעילות מוטגנית, מסרטנת והתפתחותית 9,10.
מקרים של הרעלת בני אדם ובעלי חיים דווחו במדינות רבות כתוצאה מבליעה של עשבי תיבול מסורתיים, תוספי מזון או תה המכילים PAs או זיהום עקיף של מזונות כגון חלב, דבש או בשר (רעיל מבליעת מרעה המכיל PAs)11,12,13. ממצאי הרשות האירופית לבטיחות מזון (EFSA) מצביעים על כך שחומרים כגון תה (צמחי) הם מקור חשוב לחשיפה אנושית ל-PAs/PANOs14. דגימות תה אינן מייצרות PAs, בעוד שצמחים המייצרים PA נמצאים בדרך כלל בגני תה (למשל, Emilia sonchifolia, Senecio angulatus ו– Ageratum conyzoides)15. בעבר נחשד כי התה עלול להיות מזוהם בחומרי PA ממפעלי הייצור שלהם במהלך הקטיף והעיבוד. עם זאת, נמצאו גם כמה עלי תה שנקטפו ביד (כלומר, ללא צמחים המייצרים ברש”פ), דבר המצביע על כך שחייבים להיות נתיבים או מקורות זיהום אחרים16. נערך ניסוי גידול משותף של סמרטוט (Senecio jacobaea) עם מליסה (Melissa officinalis), נענע חריפה (Mentha piperita), פטרוזיליה (Petroselinum crispum), קמומיל (Matricaria recutita) וצמחים nasturtium (Tropaeolum majus), והתוצאות הראו כי PAs זוהו בכל הצמחים הללו17. הוכח כי הרש”פ אכן מועבר ומוחלף בין צמחים חיים דרך אדמה18,19. Van Wyk et al.20 מצאו כי תה רויבוס (Aspalathus linearis) היה מזוהם קשות באתרים עשירים בעשבים והכיל PAs מאותו סוג ופרופורציה. עם זאת, לא נמצאו PAs בתה רויבוש באתרים נטולי עשבים.
נכון לעכשיו, ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC-MS/MS) עם סלקטיביות ורגישות גבוהות נמצאת בשימוש נרחב בניתוח האיכותי והכמותי של PAs במוצרים חקלאיים ומזון21,22. שיטת הטיפול לדוגמה מורכבת בדרך כלל מיצוי פאזה מוצקה (SPE) או ניקוי QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) של תמציות מטריצות מזון מורכבות, אשר יכול להשיג את הרגישות הגבוהה ביותר האפשרית12,19. עם זאת, שיטות אנליטיות חזקות המאפשרות זיהוי וכימות של PAs במטריצות מורכבות כמו אדמה, עשבים שוטים ועלי תה טריים עדיין חסרות.
מחקר זה ניתח 15 PAs בדגימות תה מיובש, עלי תה טריים, עשבים שוטים ודגימות קרקע ריזוספריות של עשבים עם UPLC-MS/MS בשילוב עם שיטת טיהור סופג. יתר על כן, 15 דגימות קרקע ריזוספריות של עשבים ועשבים ו-60 דגימות עלי תה טריים נאספו מחמישה אתרי דגימה בגן התה ג’ינז’אי במחוז אנחווי, סין, ונותחו עבור 15 PAs. תוצאות אלה יכולות לספק שיטת סקר ומידע מסוים על המקור והמסלול של PAs (זיהום) בדגימות תה כדי להבטיח את האיכות והבטיחות של תה.
Protocol
Representative Results
Discussion
העבודה הנוכחית נועדה לפתח שיטה יעילה ורגישה לחקר נתיבי הזיהום והמקורות של PAs בדגימות תה, כמו גם את התפלגות הרש”פ בחלקים שונים של צמחי התה. עם זאת, במחקר זה, רק 15 PAs הופרדו בהצלחה על העמודה הכרומטוגרפית, שהוא מספר קטן מאוד בהשוואה למספר הגדול של אלקלואידים במיני צמחים 3,4<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32102244), הפרויקט הלאומי לאיכות ובטיחות והערכת סיכונים של מוצרים חקלאיים (GJFP2021001), הקרן המדעית הטבעית של מחוז אנחווי (19252002) ומשרד החקלאות האמריקאי (HAW05020H).
Materials
| Acetonitrile (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115197 | CAS No:75-05-8 |
| Ammonia (25%-28%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 181210 | CAS No:1336-21-6 |
| Ammonium formate (97.0%) | Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) | G0860050 | CAS No:540-69-2 |
| Carbon-GCB | CNW | B7760030 | 120-400 MESH, 10g. per box |
| Centrifuge Z 36 HK | HERMLE | Z36HK | 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm |
| Commercially available tea product | Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun | loose tea | Green tea |
| Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) | BioCrick | 323256 | CAS No:65582-53-8 |
| Europine (Eu) (98.0%) | BioCrick | 98222 | CAS No:570-19-4 |
| Formate (98.0%) | Aladdin | E2022005 | CAS No:64-18-6 |
| HC-C18 | CNW | D2110060 | 40-63 μm,100g.per box |
| Heliotrine (He) (98.0%) | BioCrick | 906426 | CAS No:303-33-3 |
| Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) | BioCrick | 22581 | CAS No:6209-65-0 |
| High speed centrifuge TG16-WS | cence | 203158000 | Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL |
| HSS T3 column | Waters | 186004976 | ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm) |
| Intermedine (Im) (98.0%) | BioCrick | 114843 | CAS No:10285-06-0 |
| Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) | BioCrick | 340066 | CAS No:95462-14-9 |
| Jacobine (Jb) (98.0%) | BioCrick | 132282048 | CAS No:6870-67-3 |
| Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) | ChemFaces | CFN00461 | CAS No:38710-25-7 |
| Methyl Alcohol (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115100 | CAS No:67-56-1 |
| PSA | Agela | P19-00833 | 40-60 μm, 60 Å 100g.per box |
| Retrorsine (Re) (98.0%) | BioCrick | 5281743 | CAS No:480-54-6 |
| Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) | BioCrick | 5281734 | CAS No:15503-86-3 |
| Senecionine (Sc) (98.0%) | BioCrick | 5280906 | CAS No:130-01-8 |
| Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) | BioCrick | 5380876 | CAS No:13268-67-2 |
| Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) | BioCrick | 6442619 | CAS No:38710-26-8 |
| Seneciphylline (Sp) (98.0%) | BioCrick | 5281750 | CAS No:480-81-9 |
| Senkirkine (Sk) (98.0%) | BioCrick | 5281752 | CAS No:2318-18-5 |
| SPE PCX | Agilent Technologies | 12108206 | Cation Mixed Mode, 6 mL |
| Sulfuric acid (97%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 1003019 | CAS No:7664-93-9 |
| Trisodium citrate | Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20121009 | CAS No:6132-04-3 |
| Ultrasonic cleaner | Supmile | KQ-600B | Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L |
| UPLC-xevoTQMS | Waters | ZPLYY-003 | Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System |
| Water bath thermostat oscillator | Guoyu instrument | SHY-2AHS | Oscillation times: 60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C |
References
- Schramm, S., Kohler, N., Rozhon, W. Pyrrolizidine alkaloids: Biosynthesis, biological activities and occurrence in crop plants. Molecules. 24 (3), 498 (2019).
- EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific opinion on pyrrolizidine alkaloids in food and feed. EFSA Journal. 9 (11), 134 (2011).
- Ma, C., et al. Determination and regulation of hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids in food: A critical review of recent research. Food and Chemical Toxicology. 119, 50-60 (2018).
- Keuth, O., Humpf, H. U., Fürst, P., Melton, L., Shahidi, F., Varelis, P. Pyrrolizidine Alkaloids: Analytical Challenges. Encyclopedia of Food Chemistry. 1, 348-355 (2019).
- Huang, D. Y., et al. Pyrrolizidine alkaloids and its source analysis in tea. Journal of Food Safety & Quality. 9 (2), 229-236 (2018).
- Liang, A. H., Ye, Z. G. General situation of the toxicity researches on Senecio. China Journal of Chinese Materia Medica. 31 (2), 93-97 (2006).
- Li, Y. H., et al. Proteomic study of pyrrolizidine alkaloid-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in rats. Chemical Research in Toxicology. 28 (9), 1715-1727 (2015).
- Jia, Z. J., et al. Catalytic enantioselective synthesis of a pyrrolizidine-alkaloid-inspired compound collection with antiplasmodial activity. The Journal of Organic Chemistry. 83, 7033-7041 (2018).
- Yang, M., et al. First evidence of pyrrolizidine alkaloid N-oxide-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in humans. Archives of Toxicology. 91 (12), 3913-3925 (2017).
- Chen, Z., Huo, J. R. Hepatic veno-occlusive disease associated with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations. Netherlands Journal of Medicine. 68 (6), 252-260 (2010).
- Mattocks, A. R. . Chemistry and Toxicology of Pyrrolizidine Alkaloid. , (1986).
- Picron, J. F., Herman, M., Van Hoeck, E., Goscinny, S. Analytical strategies for the determination of pyrrolizidine alkaloids in plant based food and examination of the transfer rate during the infusion process. Food Chemistry. 266, 514-523 (2018).
- Kowalczyk, E., Kwiatek, K. Application of the sum parameter method for the determination of pyrrolizidine alkaloids in teas. Food Additives & Contaminants: Part A. 37 (4), 622-633 (2020).
- EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Risks for human health related to the presence of pyrrolizidine alkaloids in honey, tea, herbal infusions and food supplements. EFSA Journal. 15 (7), 04908 (2017).
- Han, H., et al. Pyrrolizidine alkaloids in tea: A review of analytical methods, contamination levels and health risk. Food Science. 42 (17), 255-266 (2021).
- Nowak, M., et al. Interspecific transfer of pyrrolizidine alkaloids: An unconsidered source of contaminations of phytopharmaceuticals and plant derived commodities. Food Chemistry. 213, 163-168 (2016).
- Selmar, D., et al. Transfer of pyrrolizidine alkaloids between living plants: A disregarded source of contaminations. Environmental Pollution. 248, 456-461 (2019).
- Izcara, S., et al. Miniaturized and modified QuEChERS method with mesostructured silica as clean-up sorbent for pyrrolizidine alkaloids determination in aromatic herbs. Food Chemistry. 380, 132189 (2022).
- Izcara, S., Casado, N., Morante-Zarcero, S., Sierra, I. A miniaturized QuEChERS method combined with ultrahigh liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids in oregano samples. Foods. 9 (9), 1319 (2020).
- Van Wyk, B. E., Stander, M. A., Long, H. S. Senecio angustifolius as the major source of pyrrolizidine alkaloid contamination of rooibos tea (Aspalathus linearis). South African Journal of Botany. 110, 124-131 (2017).
- Johnson, A. E., Molyneux, R. J., Merrill, G. B. Chemistry of toxic range plants. Variation in pyrrolizidine alkaloid content of Senecio, Amsinckia, and Crotalaria species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 33 (1), 50-55 (1985).
- Vrieling, K., de Vos, H., van Wijk, C. A. M. Genetic analysis of the concentrations of pyrrolizidine alkaloids in Senecio jacobaea. Phytochemistry. 32 (5), 1141-1144 (1993).
- Han, H. L., et al. Development, optimization, validation and application of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids and pyrrolizidine alkaloid N-oxides in teas and weeds. Food control. 132, 108518 (2022).
- Bodi, D., et al. Determination of pyrrolizidine alkaloids in tea, herbal drugs and honey. Food Additives & Contaminants: Part A. 31 (11), 1886-1895 (2014).
- European Union Commission. Commission Regulation (EU) 2020/2040 of 11 December 2020 amending Regulation (EC) No 1881/2006 as regards maximum levels of pyrrolizidine alkaloids in certain foodstuffs. Official Journal of the European Union. 14 (12), 1-4 (2020).
