Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

نموذج فأر للتنبيب الرغامي وجراحة نقص تروية الرئة المهواة

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64383
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 1
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco and San Francisco General Hospital, 2Department of Physiology, School of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, 3Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

نموذج جراحي للفأر لإنشاء إصابة نقص تروية الرئة اليسرى (IR) مع الحفاظ على التهوية وتجنب نقص الأكسجة.

Abstract

غالبا ما تنتج إصابة نقص التروية (IR) عن عمليات تنطوي على فترة عابرة من تدفق الدم المتقطع. في الرئة ، تسمح الأشعة تحت الحمراء المعزولة بالدراسة التجريبية لهذه العملية المحددة مع استمرار التهوية السنخية ، وبالتالي تجنب العمليات الضارة المركبة لنقص الأكسجة وانخماص الرئة. في السياق السريري ، تحدث إصابة نقص تروية الرئة (المعروفة أيضا باسم IRI الرئوية أو LIRI) بسبب العديد من العمليات ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الانسداد الرئوي ، والصدمات النزفية التي تم إنعاشها ، وزرع الرئة. توجد حاليا خيارات علاج فعالة محدودة ل LIRI. هنا ، نقدم نموذجا جراحيا قابلا للانعكاس للأشعة تحت الحمراء للرئة يتضمن التنبيب الرغامي الأول متبوعا بنقص تروية الرئة اليسرى من جانب واحد وإعادة التروية مع التهوية السنخية المحفوظة أو تبادل الغازات. تخضع الفئران لبضع الصدر الأيسر ، والذي يتم من خلاله كشف الشريان الرئوي الأيسر وتصوره وعزله وضغطه باستخدام عقدة منزلقة قابلة للعكس. ثم يتم إغلاق الشق الجراحي خلال فترة نقص تروية الحيوان ، ويتم إيقاظ الحيوان وتنبيبه. مع تنفس الفأر تلقائيا ، يتم إنشاء إعادة التروية عن طريق تحرير العقدة المنزلقة حول الشريان الرئوي. يسمح نموذج البقاء على قيد الحياة ذو الصلة سريريا بتقييم إصابة الأشعة تحت الحمراء في الرئة ، ومرحلة الحل ، والتأثيرات النهائية على وظائف الرئة ، بالإضافة إلى النماذج ذات الضربتين التي تنطوي على الالتهاب الرئوي التجريبي. على الرغم من أنه يمثل تحديا تقنيا ، إلا أنه يمكن إتقان هذا النموذج على مدار بضعة أسابيع إلى أشهر مع معدل بقاء أو نجاح نهائي يتراوح بين 80٪ و 90٪.

Introduction

يمكن أن تحدث إصابة نقص التروية (IR) عند استعادة تدفق الدم إلى عضو أو سرير الأنسجة بعد فترة من الانقطاع. في الرئة ، يمكن أن تحدث الأشعة تحت الحمراء بمعزل عن العمليات الضارة الأخرى أو بالاقتران معها مثل العدوى ، نقص الأكسجة ، انخماص الرئة ، الصدمة المتقلبة (من أحجام المد والجزر العالية أثناء التهوية الميكانيكية) ، الرضح الضغطي (ذروة عالية أو ضغوط مستمرة أثناء التهوية الميكانيكية) ، أو إصابة كدمة رئوية حادة (غير مخترقة)1،2،3 . لا تزال هناك العديد من الثغرات في معرفتنا حول آليات LIRI وتأثير العمليات المتزامنة (مثل العدوى) على نتائج LIRI ، وكذلك خيارات علاج LIRI محدودة. مطلوب نموذج في الجسم الحي من LIRI النقي لتحديد الفيزيولوجيا المرضية لإصابة الأشعة تحت الحمراء في الرئة بمعزل عن غيرها ودراسة مساهمتها في أي عملية متعددة الضربات تكون إصابة الرئة مكونا منها.

يمكن استخدام نماذج الأشعة تحت الحمراء لرئة الفئران لدراسة الفيزيولوجيا المرضية الخاصة بالرئة لعمليات متعددة ، بما في ذلك زرع الرئة3 ، والانسداد الرئوي4 ، وإصابة الرئة بعد الصدمة النزفية مع الإنعاش5. تشمل النماذج المستخدمة حاليا زرع الرئة الجراحي6 ، وتثبيت النقيب7 ، وتروية الرئة خارج الجسم الحي 8 ، والرئة المهواةIR 9. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لنموذج الأشعة تحت الحمراء للرئة ذات التهوية الفئرانية لإصابة الرئة المعقمة. هناك فوائد متعددة لهذا النهج (الشكل 2) ، بما في ذلك أنه يحفز الحد الأدنى من نقص الأكسجة والحد الأدنى من انخماص الرئة ، وهو نموذج جراحة البقاء على قيد الحياة الذي يسمح بإجراء دراسات طويلة الأجل.

أسباب اختيار هذا النموذج من LIRI على نماذج أخرى مثل نماذج لقط الهيلار ونماذج التروية خارج الجسم الحي هي كما يلي: يقلل هذا النموذج من المساهمات الالتهابية للانخماص والتهوية الميكانيكية ونقص الأكسجة. يحافظ على التهوية الدورية ؛ يحافظ على سلامة الجهاز المناعي للدورة الدموية في الجسم الحي الذي يمكن أن يستجيب لإصابة الأشعة تحت الحمراء ؛ وأخيرا ، كإجراء للبقاء على قيد الحياة ، فإنه يسمح بالتحليل طويل الأجل لآليات توليد الإصابات الثانوية (نماذج 2-hit) وحل الإصابة. بشكل عام ، نعتقد أن نموذج الأشعة تحت الحمراء للرئة المهوى يوفر الشكل "الأنقى" لإصابة الأشعة تحت الحمراء التي يمكن دراستها تجريبيا.

وصفت منشورات أخرى استخدام التنبيب الرغامي للفئران لإجراء حقن تكنولوجيا المعلومات أو التركيبات10,11 ، ولكن ليس كنقطة انطلاق لجراحة البقاء على قيد الحياة كما هو الحال في هذا النموذج. يسمح وضع أنبوب القصبة الهوائية بإجراء جراحة الرئة عن طريق السماح بانهيار الرئة الجراحية. كما يسمح بإعادة تضخم الرئة في نهاية الإجراء ، وهو أمر بالغ الأهمية لاسترواح الصدر ولقدرة الفأر على العودة إلى التهوية التلقائية في نهاية الإجراءات. أخيرا ، تعد إزالة أنبوب القصبة الهوائية الآمن إجراء بسيطا ، على عكس بضع القصبة الهوائية الغازي ، يتوافق مع جراحة البقاء على قيد الحياة. وهذا يسمح بإجراء دراسات بحثية طويلة الأجل تركز على فهم تطور وحل LIRI والاضطرابات المرتبطة به ، بالإضافة إلى إنشاء نماذج الإصابات المزمنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات والخطوات الموضحة أدناه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو. يمكن استخدام أي سلالة فأر ، على الرغم من أن بعض السلالات لديها استجابة التهابية أكثر قوة في الرئة بالأشعة تحت الحمراء مقارنة بغيرها12. الفئران التي يبلغ عمرها حوالي 12-15 أسبوعا (30-40 جم) أو أكبر تتحمل وتنجو من جراحة الأشعة تحت الحمراء للرئة بشكل أفضل من الفئران الأصغر سنا. يمكن استخدام كل من الفئران الذكور والإناث لهذه العمليات الجراحية.

1. بروتوكول التنبيب بالماوس

  1. التخدير والتحضير للتنبيب
    1. امسح بطن الفأر بمسحة الإيثانول. تخدير الفأر بحقن ثلاثي برومو إيثانول داخل الصفاق (250-400 ملغم/كغ). تقييم العمق المناسب للتخدير من خلال عدم وجود منعكس سحب دواسة. ضع مرهم ترطيب العين الآن أو لاحقا (الخطوة 2.1.4).
      ملاحظة: بالنسبة لهذا الإجراء ، يوفر ثلاثي برومو إيثانول (وإيتوميدات كخيار بديل) مستوى مخدر مستقر دون التأثير على ظروف الدورة الدموية المطلوبة لهذه الجراحة. يستخدم هذا المخدر مرة واحدة فقط لتجنب خطر الالتصاقات البريتونية. يمكن أيضا استخدام الأيزوفلوران ، لكننا لا نستخدمه هنا. الممارس حر في استخدام أي وصفة مخدرة يراها مناسبة.
    2. ضع الفأر المخدر على حامل التنبيب أو دعامة بلاستيكية في وضع ضعيف ، معلقا بواسطة قواطعه العلوية على خيوط 4-0 حلقية (حرير أو غيرها) عبر مرساة دعم.
    3. للحفاظ على تثبيت الماوس أثناء إجراء التنبيب ، قم بلصق الجزء السفلي من الصدر (أو كلا الطرفين العلويين) بشكل غير محكم على المنصة.
    4. ضع ضوء الألياف الضوئية المرن برفق على القصبة الهوائية للماوس ، أسفل الحبال الصوتية بقليل. اضبط مستوى الإضاءة بحيث لا يظهر سوى حقل مظلم عند النظر إلى البلعوم الفموي للفأر باستثناء الضوء الأحمر المنبعث من أسفل الحبال الصوتية ، مما يدل على الهدف من وضع الأنبوب الرغامي في نهاية المطاف. لاحظ أن حركات الأحبال الصوتية يجب أن تكون مرئية بالعين المجردة أو ، إذا لزم الأمر ، تحت التكبير.
  2. إجراء التنبيب
    1. امسك الملقط باليد المهيمنة واستخدمها للإمساك بلطف وسحب اللسان من تجويف الفم.
    2. افتح الفك السفلي باستخدام ملقط تمسكه اليد غير المهيمنة ، ثم ادفع الملقط إلى الحنجرة لرفع لسان المزمار برفق. في هذا الوقت ، حرر اللسان من الملقط.
    3. ابحث عن الحبال الصوتية. يجب أن تفتح وتغلق حسب كل نفس. أمسك القنية بسلك التوجيه المحمل مسبقا ، أدخل طرف السلك عبر الحبال الصوتية.
    4. مع الحرص الشديد على عدم تحريك السلك عن طريق إمساك جزء منه خارج القنية ولكن فوق الحبال الصوتية مباشرة ، اسحب القنية ، تاركا السلك في مكانه مع نهايته البعيدة داخل القصبة الهوائية.
    5. في هذه المرحلة ، قم بإجراء تصور ثان للأحبال الصوتية للتأكد من أن الطرف السلكي البعيد لا يزال يمر عبر الحبال الصوتية المضيئة إلى القصبة الهوائية ، وليس في المريء غير المضاء.
    6. أمسك السلك خارج الفم باستخدام الملقط المنحني في اليد اليسرى ، واستقر على سطح صلب ، وقدم بعناية قسطرة 20G بأجنحة شريطية فوق السلك.
    7. بمجرد خروج الطرف البعيد للسلك من الطرف الخلفي للقسطرة 20G أو الأنبوب الرغامي ، أمسك هذا الطرف بالملقط المنحني ودفع قسطرة 20G بسلاسة إلى القصبة الهوائية.
    8. قم بإزالة السلك بعناية من الطرف البعيد للقسطرة 20G باستخدام الملقط المنحني دون إزاحة موضع القسطرة.
    9. قم بتوصيل القسطرة بجهاز التنفس الصناعي لفترة وجيزة قبل تثبيتها لتأكيد وضعها الصحيح في القصبة الهوائية وليس المريء. تأكيد وضع القصبة الهوائية من خلال مراقبة حركات جدار الصدر الثنائية المعتمدة على التهوية الميكانيكية وغياب تضخم المعدة.
  3. ما بعد التنبيب
    1. افصل القسطرة عن جهاز التنفس الصناعي. ثبت أجنحة الشريط (متصلة بالقسطرة) من خلال الشفة السفلية للماوس باستخدام خياطة فيكريل 4-0 لتأمين أنبوب القصبة الهوائية (ETT) بالماوس بإحكام أثناء جميع الإجراءات / التلاعب اللاحقة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام شريط حريري أو شريط آخر لتأمين ETT ، ولكن يجب توخي الحذر لتجنب إزاحة ETT أثناء حركة الحيوان من زلاجة التنبيب إلى السطح الجراحي.
    2. قم بإزالة الماوس بعناية من زلاجة التنبيب. قم بتوصيل القسطرة لفترة وجيزة بجهاز التنفس الصناعي عند حجم المد والجزر 0.2-0.225 مل ومعدل التنفس من 120-150 نفسا في الدقيقة لتأكيد وضع القصبة الهوائية الصحيح لأنبوب القصبة الهوائية ثم افصل مع الفأر الذي يتنفس تلقائيا من خلال أنبوب القصبة الهوائية.
    3. لا تترك الحيوان دون مراقبة من هذه النقطة فصاعدا حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي في نهاية الإجراء.

2. بروتوكول جراحة نقص تروية الرئة وإعادة التروية (IR)

  1. تسكين وإعداد موقع الجراحة
    1. امسح بطن الفأر بمسحة الإيثانول وحقن البوبرينورفين (0.05-0.1 مجم / كجم) داخل الصفاق.
    2. حلق الشعر على منطقة الصدر اليسرى حتى لوح الكتف الأيسر. إزالة الشعر حلق الزائد باستخدام مسحات الكحول.
      ملاحظة: يمكن أيضا تنفيذ الخطوتين 2.1.1 و 2.1.2 قبل التنبيب إذا كان هناك قلق من إزاحة ETT عند تأمينه بشريط حريري.
    3. ضع الماوس على وسادة تدفئة في وضع جانبي أيسر أو 3/4 مقلوب وقم بتوصيل أنبوب القصبة الهوائية على جهاز التنفس الصناعي بحجم مد وجزر يبلغ 0.2-0.225 مل (~ 8 مجم / كجم) ومعدل تنفس 120-150 نفسا في الدقيقة. لا تستخدم الأكسجين التكميلي لهذا الإجراء.
    4. ضع مادة تشحيم العين بقطعة قطن معقمة. أدر الماوس إلى 3/4 الجانب الأيسر لأعلى وشل حركة الأطراف الأربعة والذيل بشريط مختبري.
    5. تطهير منطقة الجلد حلق والفراء المحيطة مع البوفيدون اليود وانتظر حتى يجف الحل. ثم قم بتغطية المجال الجراحي بستارة معقمة أو فيلم بلاستيكي شفاف وقم بإنشاء فتحة مستطيلة في الستارة أو فيلم بلاستيكي للمجال الجراحي.
  2. الإجراء الجراحي
    1. تأكد من المستوى المناسب للتخدير (المقدم من إعطاء ثلاثي برومو إيثانول والبوبرينورفين كما هو موضح سابقا) عن طريق اختبار الاستجابة لقرص إصبع القدم.
    2. باستخدام زوج من المقصات الحادة وزوج من الملقط الأكبر (ملقط ضيق النمط أو ما شابه) ، قم بعمل شق جلدي عرضي 2 سم أسفل الزاوية السفلية للكتف في الصدر الجانبي الأيسر. استخدم المقص وزوج أدق من الملقط (ملقط جراف ناعم للغاية أو ما شابه) لقطع الطبقة العضلية وتشريحها وصولا إلى الضلوع.
    3. حدد المساحة الوربية الثانية وأمسك الضلع الثاني بالملقط الناعم للغاية. سحب الضلع لأعلى ، استخدم شفرة مشرط معقمة # 11 أو # 12 (منحنية) (لا يلزم مقبض) لدخول الفضاء الجنبي عن طريق فصل وقطع العضلات الوربية للفضاء 2nd-3 rd . ضع في اعتبارك إيقاف التهوية مؤقتا لتقليل إصابة قمة الرئة اليسرى.
    4. أدخل ثلاثة مبعدات معقمة. استخدم أصغر / أضيق مبعدة cephalad على طول اتجاه الأضلاع ، والضلع متوسط الحجم إلى اليسار على طول الضلع 2، وأكبر مبعدة إلى اليمين على طولسطح الضلع 3.
    5. افتح الصدر بتراجع بطيء وتدريجي باستخدام الحبال الضاحكة المرنة. كشف وتحديد الشريان الرئوي الأيسر (PA) عن طريق تحريك قمة الرئة اليسرى بعيدا بمسحة قطنية معقمة.
    6. استخدم الملقط الصغير ، والملقط متناهي الصغر في اليد اليمنى وملقط PA أو ملقط توسيع الأوعية في اليد اليسرى ، لفضح وإنشاء المجال الذي يكون فيه كل من PA الأيسر والشعب الهوائية مرئيا.
    7. باستخدام ملقط PA ، التقط PA الأيسر واسحبه برفق ولكن بثبات لأعلى و cephalad لتصور القصبات الهوائية الشفافة أدناه. قم بزيادة التكبير على مجهر التشريح (انظر قائمة المعدات لمزيد من التفاصيل) في هذه المرحلة إلى الحد الأقصى (2x).
      ملاحظة: تعقيم جميع المعدات قبل الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك ، للحفاظ على العقم ، يجب أن تدخل أطراف الأدوات الجراحية فقط إلى المجال الجراحي المعقم.
    8. أثناء سحب السلطة الفلسطينية بعيدا عن القصبات الهوائية ، مرر بعناية الملقط متناهي الصغر المغلق عبر الفراغ بين PA الأيسر والشعب الهوائية. بعد ذلك ، استخدم هذه الملقط لعقد وسحب 7-0 أو 8-0 خياطة البرولين من خلال الفراغ بين الشريان الرئوي الأيسر (أعلاه) والشعب الهوائية (أدناه).
    9. تطويق السلطة الفلسطينية اليسرى عن طريق ربط عقدة منزلقة لخلق انسداد في السلطة الفلسطينية. يمكن تصور انقطاع تدفق الدم بسهولة تحت المجهر. هذا يمثل بدء الفترة الإقفارية.
    10. قم بإخراج الطرف الحر للعقدة من خلال نقطة دخول مختلفة في الصدر الأيسر الأمامي باستخدام إبرة 24G-28G وتأمين نهاية الخيط بقطعة صغيرة من الشريط لتسهيل التعرف عليها لاحقا.
    11. أعد نفخ الرئة لطرد أكبر قدر ممكن من الهواء من تجويف الصدر باستخدام صمام / أنبوب PEEP على جهاز التنفس الصناعي للقوارض. ثم أغلق القفص الصدري بخيطين من النايلون 4-0 متقطعين.
    12. أغلق العضلات والطبقة تحت الجلد بخياطة نايلون 4-0. ثم ضع قطرتين أو ثلاث قطرات من البوبيفاكايين الموضعي (0.5٪) على الشق. استخدم خياطة نايلون 4-0 لإغلاق طبقة الجلد بخياطة جارية.
  3. رعاية ما بعد الجراحة
    1. عند استئناف التهوية التلقائية ، افصل أنبوب القصبة الهوائية عن جهاز التنفس الصناعي وقم بإخراج أنبوب الماوس.
    2. ضع الماوس على وسادة التسخين للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء التعافي المبكر بعد التخدير.
    3. راقب الماوس بعناية أثناء التعافي من التخدير العام. اسحب العقدة الخارجية برفق في نهاية فترة نقص تروية (30 دقيقة أو 1 ساعة).
    4. حرك الماوس من وسادة التسخين إلى القفص بمجرد ظهور علامات التعافي: تصحيح ذاتي و / أو حركة.
    5. بعد فترة التروية (1 ساعة أو 3 ساعات) ، قم بالقتل الرحيم للحيوان وجمع الدم عن طريق ثقب القلب وأنسجة الرئة لمزيد من التحليل. ل 1 ساعة إعادة التروية ، وجمع البلازما ل ELISA ، والأنسجة للحمض النووي الريبي ، وتحليل البروتين. لإعادة ضخ 3 ساعات ، بالإضافة إلى جمع الأنسجة للأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الالتهاب الناتج عن إصابة نقص تروية الرئة المعقمة ذات التهوية الأحادية الجانب (IR): بعد 1 ساعة من نقص التروية ، لاحظنا زيادة مستويات السيتوكينات في المصل وداخل أنسجة الرئة بواسطة كل من ELISA و qRT-PCR التي بلغت ذروتها في 1 ساعة بعد إعادة التروية وعادت بسرعة إلى خط الأساس في غضون 12-24 ساعة بعد إعادة التروية13. بالنسبة للعينات التي تم جمعها في 3 ساعات بعد إعادة التروية ، لاحظنا تسلل العدلات الشديد داخل أنسجة الرئة اليسرى ولاحظنا أن شدة الالتهاب كانت تعتمد على سلالة الفئران المستخدمة (الشكل 1). والجدير بالذكر أن الالتهاب الذي يتولد في غياب عملية معدية متعايشة أو لاحقة يحل تدريجيا وتعود الرئتان إلى بنية الرئة الطبيعية (عن طريق علم أمراض الأنسجة) مع كثرة الكريات أو خروج العدلات من الرئتين المصابة في غضون 12-24 ساعة بعد إعادة التروية13. من الجدير بالذكر أننا لاحظنا التهابا خفيفا ولكن يمكن اكتشافه ، والذي كان إلى حد كبير عدلات ولوحظ في الرئة اليمنى غير الجراحية أيضا ، والذي نفترض أنه بسبب إصابة فرط التروية14.

لا يختلف جمع عينات الأنسجة لنموذج الأشعة تحت الحمراء للرئة هذا عن نماذج الأشعة تحت الحمراء الأخرى للرئة: يمكن جمع الدم لإعداد البلازما عن طريق ثقب القلب أو قنية IVC. يمكن حصاد أنسجة الرئة لإعداد البروتين أو الحمض النووي الريبي ثم لمزيد من التحليل بواسطة اللطخة الغربية أو ELISA أو qPCR.

Figure 1
الشكل 1: أنسجة أقسام الرئة في الفئران البرية من سلالتين مختلفتين. أ: C3H و (ب) فئران C57BL/6. تلقت كلتا السلالتين من الفئران نقص تروية 1 ساعة و 3 ساعات من التروية ، ويظهر النسيج عند تكبير 10x. يظهر التكبير 40x في الجزء الداخلي. لوحظ تسلل العدلات في كلتا السلالتين ، حيث أظهرت سلالة C3H مستويات أكبر بشكل ملحوظ من الالتهاب مقارنة ب C57BL / 6 كما ورد في وقت سابق12. شريط المقياس هو 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: مقارنة المزايا (النص الأزرق) والعيوب (النص الأحمر) للنماذج الثلاثة الأكثر استخداما لإصابة الأشعة تحت الحمراء للرئة (LIRI) للفأر. تسلط هذه المقارنة الضوء على اختيار الأشعة تحت الحمراء للرئة ذات التهوية (الموصوفة في هذه المخطوطة) كنموذج مثالي لدراسة الأشعة تحت الحمراء النقية للرئة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توضح هذه المخطوطة بالتفصيل الخطوات المتبعة في تنفيذ نموذج الأشعة تحت الحمراء للرئة ذات التهوية التي طورها Dodd-o et al.9. ساعد هذا النموذج في تحديد المسارات الجزيئية المشاركة في توليد وحل الالتهاب من الأشعة تحت الحمراء الرئوية في عزلة14،15،16،17 ، والأشعة تحت الحمراء للرئة بالاشتراك مع العدوى الموجودة 18 ، والأشعة تحت الحمراء للرئة فيما يتعلق بمحور الأمعاء والرئة ومساهمة ميكروبيوم الأمعاء 13،18،19 . في حين أن النموذج الحالي أكثر تحديا من الناحية الفنية ، إلا أنه يسمح بتقييم الأشعة تحت الحمراء للرئة دون الآثار المركبة لتضخم الرئة الدوري المتقطع ونقص الأكسجة. كما أنه يقلل من فترة التعرض للتهوية الميكانيكية ، على عكس نموذج التروية خارج الجسم الحي ، والذي يمكن أن يؤدي في حد ذاته إلى إصابة الرئة20.

حدود الطريقة: في حين أن القصبة الهوائية للفأر مدببة بدرجة كافية بحيث يسمح ضغط الزفير الإيجابي (PEEP) بتوسيع الرئتين ويوفر ملاءمة مريحة ل ETT ، قد لا تكون ميكانيكا الرئة وقياسات حلقة حجم التدفق ممكنة مع هذا الإصدار من التنبيب الرغامي القابل للعكس. قد تتطلب قياسات فسيولوجيا الرئة هذه بضع القصبة الهوائية ، والتي ، على عكس هذه الطريقة ، لا تتوافق مع جراحة الرئة للبقاء على قيد الحياة. التنبيب الرغامي العكسي جيد التحمل من قبل الفئران ، وحتى في حالة عدم وجود الشلل ، هناك القليل جدا من عدم تزامن جهاز التنفس الصناعي للفأر بشرط أن تكون التهوية الدقيقة (MV = حجم المد والجزر × معدل التنفس) عالية بما يكفي لمنع محرك CO2 الطبيعي الذي يحركه التنفس (أي بعد عتبة انقطاع النفس مباشرة).

هناك العديد من الاعتبارات المتعلقة بجزء نقص التروية (IR) من هذا الإجراء. أولا ، يجب إجراء إجراء الأشعة تحت الحمراء بأقل قدر ممكن من الصدمات الجسدية للرئة. نوصي بإيقاف التهوية الميكانيكية مؤقتا والسماح للماوس بالتنفس تلقائيا عند دخول التجويف الصدري. تهوية الضغط السلبي ، جنبا إلى جنب مع إمساك الجراح للضلع الثاني أو الثالث وسحبه بعيدا عن الرئة أثناء دخول الصدر بعناية بشفرة مشرط # 11 ، سيقلل من فرصة إصابة الرئة بالمشرط. بدلا من ذلك ، وجدنا أن استخدام شفرة مشرط منحنية # 12 ، موضوعة بحيث يواجه المنحنى لأعلى ، يسمح بدخول أكثر حذرا إلى التجويف الصدري ، مما قد يقلل من إصابة سطح قمة الرئة اليسرى الأساسي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاتصال بين PA الأيسر والشعب الهوائية أقل أمانا بالقرب من الهيلوم ، مما يجعل مرور الملقط متناهي الصغر بين هذين الهيكلين أسهل هنا.

الخطوة الحاسمة التالية هي عزل السلطة الفلسطينية اليسرى عن القصبات الهوائية أدناه لتطويق السلطة الفلسطينية بربطة خياطة. من الضروري إنجاز هذه الخطوة بعناية لتجنب الصدمة في قمة الرئة. نوصي بإدخال القفص الصدري كسيفالاد قدر الإمكان لتقليل كمية الرئة اليسرى التي تحتاج إلى إزاحتها أو سحبها للوصول إلى السلطة الفلسطينية والشعب الهوائية. يجب استبعاد أي جزء من الرئة يعاني من صدمة حادة من تقييم إصابة الأشعة تحت الحمراء المعزولة. في كثير من الأحيان ، يتم استئصال قمة الرئة اليسرى عند جمع الرئتين للتحليل النهائي لإصابة الرئة بالأشعة تحت الحمراء المعقمة. يمكن تصور إصابة قمة الرئة أثناء الجراحة بسبب وجود نقاط من النزيف أو تغير اللون الدموي.

بين السلطة الفلسطينية والشعب الهوائية أدناه توجد طبقة نسيج ضام يجب اختراقها لتطويق الشريان بربطة الخياطة. إن معرفة مقدار التوتر المسموح به أثناء الإمساك بالسلطة الفلسطينية اليسرى وسحبها لأعلى (أي باتجاه القفص الصدري وبعيدا عن القصبات الهوائية) ، باستخدام الوعاء غير المسنن وغير الضار الذي يمسك بالملقط الناعم المسطح في اليد اليسرى ، هو خطوة أولى مهمة يجب إتقانها. يمكن للسلطة الفلسطينية اليسرى تحمل قدر مدهش من التوتر والتمدد أثناء سحبها لأعلى. نجد أنه من المفيد زيادة تكبير المجال البصري إلى أقصى حد وضبط التركيز بحيث يمكن تصور المساحة المحتملة (خط أبيض من النسيج الضام يلتصق بالسلطة الفلسطينية بالشعب الهوائية) بوضوح وبشكل حاد جنبا إلى جنب مع الملقط متناهي الصغر (يمسك في اليد اليمنى). لكي يظل المجال في بؤرة التركيز ، من المهم تثبيت اليد اليسرى على سطح الجراحة أثناء سحب PA الأيسر لأعلى وبعيدا عن القصبات الهوائية. يمكن بعد ذلك تمرير الملقط متناهي الصغر في الفراغ بين الهيكلين. يجب أن تمر الأطراف المغلقة بسهولة دون أي مقاومة حقيقية ، وبمجرد رؤيتها على الجانب الآخر من السلطة الفلسطينية اليسرى ، يمكن فتح الأطراف برفق لتوفير مساحة أكبر لمرور مادة الخياطة. من الأهمية بمكان أن يتم ذلك باستخدام ملقط متناهي الصغر غير تالف تماما ، والذي يمكن تحديده بسرعة عن طريق سحب مسحة كحول معقمة من خلال الأطراف المغلقة لمراقبة ما إذا كانت الأطراف تمزق المادة. يمكن أيضا تحديد أطراف الضرر عن طريق فتح وإغلاق الملقط تحت التكبير الأقصى للمجهر الجراحي.

من السهل اكتشاف الضرر الذي يحدث إما للسلطة الفلسطينية اليسرى أو الشعب الهوائية الرئيسية اليسرى أثناء محاولة فصلها. يؤدي تلف السلطة الفلسطينية اليسرى إلى إغراق المجال البصري بالدم ويمكن أن يؤدي إلى جراحة غير قابلة للإصلاح إذا كان الضرر يخلق ثقبا داخل السلطة الفلسطينية نفسها. والجدير بالذكر أن هناك أوعية دموية مجهرية سطحية على السلطة الفلسطينية قد تصاب أثناء حركة الملقط متناهي الصغر ويمكن إدارتها عن طريق وضع مسحة جافة معقمة من القطن فوق الحقل لامتصاص الدم الذي يظهر. إذا توقف النزيف ، يمكن استئناف الإجراء. الأضرار التي لحقت القصبات الهوائية الرئيسية اليسرى هي دائما حالة غير قابلة للإصلاح لأنه لا توجد طريقة بسيطة أو سريعة لإصلاح تلف مجرى الهواء.

يمكن ممارسة خطوة فصل السلطة الفلسطينية عن القصبات الهوائية الأساسية في البداية على فأر ميت دون ضغط الوقت أو تشتيت نشاط القلب والحركة التي يسببها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ركود الدم في السلطة الفلسطينية اليسرى يسمح بتصوره بسهولة أكبر (وعاء سميك وممتلئ) ، ومع ذلك لا يزال قادرا على التقاطه بواسطة ملقط السلطة الفلسطينية المسطح غير المصاب. لا تزال القدرة على اكتشاف الضرر في القصبات الهوائية اليسرى ممكنة ، حيث يمكن استخدام تهوية الرئة اليسرى لتقييم وجود مجرى هوائي سليم إلى الرئة اليسرى. يمكن أيضا استخدام موقف الممارسة هذا لإتقان إنشاء عقدة المنزلقة.

هناك مدة محدودة من الانسداد ، وبعد ذلك لا يتم ضمان إعادة التروية التلقائية بعد إزالة العقدة المنزلقة. في الدراسات التجريبية ، يحدث هذا في مكان ما بين 6 و 10 ساعات. أبعد من ذلك ، يحدث إعادة التروية مباشرة بعد إزالة العقدة. مع امتداد فترة نقص تروية الدم ، يتطلب إعادة التروية التلاعب بالسلطة الفلسطينية بعد إزالة العقدة المنزلقة من أجل إعادة تدفق الدم.

تم الحصول على هذه الملاحظات التالية من خمسة مؤلفين مشاركين في هذه الورقة والتي تمثل تجربتهم الجماعية في تعلم هذا الإجراء وإتقانه واستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتحسينه خلال الفترة التي أجروا فيها هذا النموذج الجراحي للفأر وتم تلخيصها في النقاط أدناه:

في المتوسط ، استغرق الأمر 1-3 أشهر لإتقان هذا الإجراء الجراحي. قدر أحد الإجرائيين أن الأمر يتطلب ما يقرب من 50 عملية جراحية لتصبح سهلة مع الإجراءات المختلفة.

كان معدل النجاح في بداية تنفيذ الإجراء 20٪ -40٪. بعد إجراء العملية بانتظام وعلى دراية ، ارتفع معدل النجاح إلى 80٪ -90٪.

كان الجزء الأكثر صعوبة في الجراحة بالإجماع هو تمرير ملقط متناهي الصغر بين السلطة الفلسطينية اليسرى والشعب الهوائية اليسرى ، ثم الالتقاط اللاحق لخيوط خيط أحادية مع الملقط وتمريرها بين الهيكلين.

يمكن أن تؤدي الأخطاء أثناء مرور الشعيرات الأحادية بين السلطة الفلسطينية والشعب الهوائية الرئيسية اليسرى إلى جراحة لا يمكن إنقاذها مع نزيف كارثي في السلطة الفلسطينية اليسرى أو إصابة لا رجعة فيها في الشعب الهوائية الرئيسية اليسرى.

قدر الحد الأقصى لعدد العمليات الجراحية الممكنة في يوم واحد ب 10 (حوالي 35-45 دقيقة / جراحة) ، في حين أن العدد المثالي للراحة الإجرائية والنجاح الجراحي كان خمسة أو ستة.

تتضمن النصائح والاقتراحات المتنوعة الأخرى ما يلي:

تجنب الكافيين الزائد قبل بدء يوم الجراحة للحفاظ على وضع اليد ثابت.

قم بزيادة التكبير على المجهر إلى الحد الأقصى أثناء جزء الإجراء عندما يتم تمرير الخيط بين السلطة الفلسطينية اليسرى والشعب الهوائية الرئيسية اليسرى.

استخدم حركات لطيفة وتدريجية / تزايدية عند دفع ملقط Dumont لتوفير مسافة بين PA الأيسر والشعب الهوائية الرئيسية اليسرى.

تثبيت اليدين على سطح الجراحة عند تنفيذ جميع الخطوات الهامة.

تأكد من أن معدل التنفس على جهاز التنفس الصناعي مرتفع بما يكفي لتجنب التنفس التلقائي ، خاصة أثناء الأجزاء الرئيسية / الحرجة من الإجراء (خياطة تمر بين السلطة الفلسطينية اليسرى والشعب الهوائية الرئيسية اليسرى).

تعد البيئة الهادئة وغير المضطربة لإجراء العمليات الجراحية أمرا ضروريا للحفاظ على التركيز وعدم تشتيت الانتباه.

يقارن الشكل 2 هذا النموذج بالنماذج البديلة لإصابة الرئة بالأشعة تحت الحمراء. يوفر هذا النموذج من نقص تروية الرئة المهواة مزايا تقليل انخماص الرئة ونقص الأكسجة والتهوية الميكانيكية. الأهم من ذلك ، كجراحة البقاء على قيد الحياة ، فهي متوافقة مع نماذج الإصابة الثانية (على سبيل المثال ، نماذج الالتهاب الرئوي التجريبية) وتحليل حل الإصابة.

في الختام ، وصفنا جراحة البقاء على قيد الحياة التي تنطوي على خلق إصابة نقص تروية الرئة التي نعتقد أنها يمكن أن توفر نظرة ثاقبة قيمة في الآليات والمسارات الخلوية التي تنطوي عليها إصابة الأشعة تحت الحمراء النقية في الرئة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من خلال دعم الأقسام من قسم التخدير والرعاية المحيطة بالجراحة ، وجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو ومستشفى سان فرانسيسكو العام ، وكذلك من خلال جائزة NIH R01 (إلى AP): 1R01HL146753.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Fiber Optic Light Pipe Cole-Parmer UX-41720-65 Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source AmScope SKU: CL-HL250-B Light source for fiberoptic lights
Germinator 500 Cell Point Scientific, Inc. No.5-1450 Bead Sterilizer
Heating Pad AIMS 14-370-223 Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper) WAHL home products SKU 09854-600B To remove mouse hair on surgical site
Microscope Nikon SMZ-10 Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator Havard Apparatus Model 845 Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner Cole-Parmer UX-08895-05 Clean tools that been used in operation
Warming Pad Kent Scientific RT-0501 To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale Cole-Parmer UX-11003-41 Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture Ethicon 683G For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture Ethicon Industry EP8734H Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use) Aspen Surgical 372611 For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel Aspen Surgical 372612 For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps FST 11150-10 Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System FST 1. Base Plate (Nos. 18200-03)
2. Fixators (Nos. 18200-01)
3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12)
4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)		 Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle COVIDIEN 05-561-20 For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps FST 11002-12 Skin level forceps
Needle holder/Needle driver FST 12565-14 for holding needles
Needles BD 305110 26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps FST 00125-11 To hold PA; non-damaging gripper
Scissors FST 14060-09 Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps FST 11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm) For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine Hospira, Inc. 0409-1159-02 Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) Sigma-Aldrich T48402-25G Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine Covetrus North America 59122 Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant BAUSCH+LOMB Soothe Lubricant Eye Ointment Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution MEDLINE INDUSTRIES INC SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic) Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab BD brand  BD 326895 for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film KIRKLAND Stretch-Tite premium Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes Stoelting 50981 Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application Pwi-Wnaps 703033 used for applying eye lubricant
Top Sponges Dukal Corporaton Reorder # 5360 Stopping bleeding from skin/muscle

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, H., Kreisel, D., Goldstein, D. R. Processes of sterile inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 2857-2863 (2013).
  2. Fiser, S. M., et al. Lung transplant reperfusion injury involves pulmonary macrophages and circulating leukocytes in a biphasic response. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 121 (6), 1069-1075 (2001).
  3. Lama, V. N., et al. Models of lung transplant research: A consensus statement from the National Heart, Lung, and Blood Institute workshop. JCI Insight. 2 (9), 93121 (2017).
  4. Miao, R., Liu, J., Wang, J. Overview of mouse pulmonary embolism models. Drug Discovery Today: Disease Models. 7 (3-4), 77-82 (2010).
  5. Mira, J. C., et al. Mouse injury model of polytrauma and shock. Methods in Molecular Biology. 1717, 1-15 (2018).
  6. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
  7. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: Tricks of the trade. The Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
  8. Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
  9. Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Faraday, N., Pearse, D. B. Effect of ischemia and reperfusion without airway occlusion on vascular barrier function in the in vivo mouse lung. Journal of Applied Physiology. 95 (5), 1971-1978 (2003).
  10. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  11. Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702 (2011).
  12. Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Welsh-Servinsky, L. E., Tankersley, C. G., Pearse, D. B. Strain-specific differences in sensitivity to ischemia-reperfusion lung injury in mice. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1590-1595 (2006).
  13. Prakash, A., et al. Lung ischemia reperfusion (IR) is a sterile inflammatory process influenced by commensal microbiota in mice. Shock. 44 (3), 272-279 (2015).
  14. Prakash, A., et al. Alveolar macrophages and toll-like receptor 4 mediate ventilated lung ischemia reperfusion injury in mice. Anesthesiology. 117 (4), 822-835 (2012).
  15. Dodd-o, J. M., et al. The role of natriuretic peptide receptor-A signaling in unilateral lung ischemia-reperfusion injury in the intact mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (4), 714-723 (2008).
  16. Prakash, A., Kianian, F., Tian, X., Maruyama, D. Ferroptosis mediates inflammation in lung ischemia-reperfusion (IR) sterile injury in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201, (2020).
  17. Tian, X., et al. NLRP3 inflammasome mediates dormant neutrophil recruitment following sterile lung injury and protects against subsequent bacterial pneumonia in mice. Frontiers in Immunology. 8, 1337 (2017).
  18. Tian, X., Hellman, J., Prakash, A. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Frontiers in Microbiology. 10, 159 (2019).
  19. Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids' immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 65-78 (2021).
  20. Dodd-o, J. M., et al. Interactive effects of mechanical ventilation and kidney health on lung function in an in vivo mouse model. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (1), 3-11 (2009).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 187 ،
نموذج فأر للتنبيب الرغامي وجراحة نقص تروية الرئة المهواة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liao, W. I., Maruyama, D., Kianian,… More

Liao, W. I., Maruyama, D., Kianian, F., Tat, C., Tian, X., Hellman, J., Dodd-o, J. M., Prakash, A. A Mouse Model of Orotracheal Intubation and Ventilated Lung Ischemia Reperfusion Surgery. J. Vis. Exp. (187), e64383, doi:10.3791/64383 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter