这里介绍的是一种方案,用于使用离体灌注系统在冷保存后可靠地量化供 体 心脏的右心室和左心室功能。
原发性移植物功能障碍 (PGD) 仍然是心脏移植后早期死亡的主要原因。冷藏期间缺血时间延长是PGD的重要危险因素,可靠的心脏功能评估对于研究供体心脏在冷藏后的功能反应至关重要。随附的视频描述了一种在不同持续时间的冷保存后使用基于 Langendorff 模型的 离体 灌注评估小鼠右心室和左心室功能的技术。简而言之,将心脏分离并储存在冷的组氨酸-色氨酸-酮戊二酸 (HTK) 溶液中。然后,在Langendorff模型中用Kreb缓冲液灌注心脏60分钟。将硅胶球囊插入左心室和右心室,并记录心脏功能参数(dP/dt,压力-容积关系)。该协议允许在不同的心脏保存方案后可靠地评估心脏功能。重要的是,该技术允许研究天然心脏细胞中的心脏保存反应。使用非常小的小鼠心脏可以接触到大量的转基因小鼠来研究PGD的机制。
心脏移植可提高终末期心力衰竭患者的生存率和生活质量1.不幸的是,心脏供体的短缺限制了可以从这种疗法中受益的患者数量,并限制了临床医生将供体与接受者进行最佳匹配的能力2,3,4。此外,自 2018 年以来,新的分配系统延长了缺血时间,并显着增加了边际供体的使用5。因此,心脏供体的平均年龄和缺血时间随着时间的推移而增加,导致原发性移植物功能障碍 (PGD) 的发生率更高,尽管心脏保存策略有显着改进 6。
PGD 可累及左心室、右心室或双心室,并且仍然是一种危及生命的并发症,是心脏移植后早期死亡的主要原因。鉴于 PDG 对心脏受者的潜在挽救生命影响,研究 PDG 的机制和制定更好的心脏保护策略是重要的考虑因素。因此,允许在长时间储存后对供体心脏功能进行稳健可靠的评估的实验模型对于增加我们对PGD的理解和促进新疗法的开发至关重要。准确评估小鼠心脏功能的能力允许获得大量可以准确识别PGD机制的转基因小鼠模型。
在生理学和药理学研究中,Langendorff 逆行灌注模型广泛用于评估心脏功能7。具体来说,心脏功能是通过连接到左心室 (LV) 腔内压力传感器的硅胶球囊来检测的。PGD的一个关键特征是心室肌肉的收缩和松弛不足。先前的 Langendorff 研究侧重于使用左心室球囊在左心室功能评估中产生可靠且可重复的结果 8,9,10。然而,使用球囊系统使用腔内球囊评估右心室 (RV) 功能不太为人所知。
鉴于移植后 RV 的显着 PGD 发生率11,研究 LV 和 RV 功能的实验方法将有助于确定导致 RV PGD 的分子和生理机制。该协议表明,腔内硅胶球囊可以提供对同一小鼠心脏12 中 LV 和 RV 功能的可靠评估。为了评估Langendorff系统在PGD研究中的潜在用途,我们检查了不同储存期的心脏功能,发现随着小鼠心脏长时间的冷藏,收缩和松弛的心脏功能下降。有趣的是,LV 的功能减少比 RV 高。总之,此处描述的方案可用于评估候选药物和分子途径对左心室和右心室功能的影响。在小鼠心脏上使用这种方法的能力将有助于进行详细的机理研究。
该协议描述了 通过 主动脉插管的逆行灌注 Langendorff 方法。该技术可用于评估冷藏后鼠心的左心室和右心室功能。结果表明,使用该方案,供体心脏的长时间冷藏会导致左心室和右心室的心脏功能降低。
心脏移植后急性和慢性排斥反应的研究广泛集中在免疫生物学上14.天然细胞在冷藏过程中对PGD的影响研究较少。PGD 发生在 ~10%-20% 的心脏移植中,占移植后 30 天内早期死亡的 66%。特别是,移植后影响左心室与右心室的 PGD 发生率不同11。在没有受体细胞反应的贡献的情况下,这种离体方法侧重于供 体 心脏冷保存后天然心脏细胞对 PGD 的贡献。进一步的研究可能会将受者反应纳入小鼠心脏移植模型中。
在该方案中,冷保存供体心脏的Langendorff灌注侧重于对温晶体灌注的天然心脏反应,而不会浸润细胞免疫。为了获得可重复的结果,对几个关键步骤进行了标准化。使用HTK溶液将小鼠心脏捕获并储存在冰冷的HTK中,类似于临床实践。用计时器密切监测每颗心脏的HTK溶液的灌注量和输注时间。供体心脏保存在4°C房间中含有HTK的冰上的预冷管中。插管时间 waas 标准化为灌注前 ~3 分钟。所有这些步骤都确保了保冷持续时间是研究中的主要变量。
在灌注开始时,通常可以看到 ~20 分钟的不规则心脏收缩力。心脏组织的逐渐变暖和氧合促进了这种平衡和恢复期。预计在最初的 20 分钟后会有一个相对稳定的时期。在初始平衡期后~18分钟将球囊插入心室腔。一旦插入球囊,我们在心脏稳定 ~25 分钟后开始记录血流动力学。用KH缓冲液灌注可保持稳定的心脏功能~1.5-2小时。因此,我们选择在左心室和右心室中记录 20 分钟的血流动力学。
逆行灌注在研究冷藏后心脏的PGD方面存在一些局限性。首先,由于球囊尺寸和每个心室腔(特别是 RV)空间不足,将两个球囊同时插入 LV 和 RV 非常具有挑战性。因此,我们依次测量 RV 和 LV 的功能。需要注意的是,室间隔对左心室和右心室功能都有显著影响。鼻中隔占右心室功能的 ~50%,因此存在心室间依赖性15。同样重要的是要注意,虽然在 Langendorff 装置中再灌注小鼠心脏的程序需要 ~3 分钟,但在相对温暖的手术区域中植入人类心脏的手术需要 ~45 分钟。相比之下,该Langendorff系统中的小鼠心脏缺血时间较短。在考虑临床转化时应考虑到这一点。
由于我们使用 KH 缓冲液在没有血液的情况下灌注心脏,因此这也可能降低氧气输送效率。然而,在灌注的最初 1.5-2 小时内,心脏功能相对稳定,因此可以进行可靠的血流动力学测量。不幸的是,目前还没有针对这些较小的小鼠心脏的可行的工作心脏灌注模型,并且无法在该系统中评估心室负荷的影响。尽管如此,与移植模型相比,灌注系统具有高度可重复性,并且劳动密集度和耗时更少。它的成本也低于移植研究,这可能使其更适合筛选不同的治疗方案和各种分子途径。通过添加候选药物对保存溶液进行修改,该平台可用于评估药理学药物对降低左心室和右心室中PGD的影响。
The authors have nothing to disclose.
没有。
4-0 silk suture | Braintree Scientific | SUTS108 | |
6-0 Silk suture | Braintree Scientific | SUTS104 | |
All purpose flour | Kroger | ||
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G | Fisher scientific | 14-826-5A | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) | Fisher scientific | 14-823-16E | |
Corn Syrup | Kroger | ||
Custodiol HTK Solution | Essential Pharmaceuticals LLC | ||
Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 14393/14394 | |
Falcon 50 mL conical tubes | Fisher scientific | 14-959-49A | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H4784 | |
Krebs Henseleit buffer | Sigma | K3753 | |
Nusil silicone dispersions | Avantor | ||
Perfusion system | Radnoti | 130101BEZ | |
PowerLab | ADInstruments | PL3508 | |
Sodium azide | Sigma | S2002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Xylazine | Sigma | X1126 |