एएवी पेप्टाइड अगली पीढ़ी के एएवी के निर्माण के लिए नए गुणों वाले उम्मीदवारों की बारकोडिंग के माध्यम से पुस्तकालय उत्पादन और बाद में सत्यापन प्रदर्शित करता है।
एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) से प्राप्त जीन डिलीवरी वैक्टर आनुवंशिक रोगों के उपचार के लिए सबसे आशाजनक उपकरणों में से एक हैं, जो नैदानिक डेटा को प्रोत्साहित करने और कई एएवी जीन उपचारों के अनुमोदन से स्पष्ट हैं। एएवी वैक्टर की सफलता के दो प्रमुख कारण हैं (i) अलग-अलग गुणों के साथ विभिन्न स्वाभाविक रूप से पाए जाने वाले वायरल सीरोटाइप का पूर्व अलगाव, और (ii) उनके आणविक इंजीनियरिंग के लिए शक्तिशाली प्रौद्योगिकियों की स्थापना और उच्च थ्रूपुट में पुन: उत्पादन। इन तकनीकों की क्षमता को और बढ़ाने के लिए हाल ही में डीएनए और आरएनए स्तर पर चयनित एएवी कैप्सिड्स को बारकोडिंग करने के लिए रणनीतियों को लागू किया गया है, जिससे एक ही जानवर में सभी प्रमुख अंगों और सेल प्रकारों में विवो स्तरीकरण में उनके व्यापक और समानांतर की अनुमति मिलती है। यहां, हम उपलब्ध कैप्सिड इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों के विविध शस्त्रागार का प्रतिनिधित्व करने के लिए एएवी पेप्टाइड डिस्प्ले का उपयोग करते हुए पूरक मार्गों के इस सेट को शामिल करते हुए एक बुनियादी पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं। तदनुसार, हम पहले वांछित गुणों वाले उम्मीदवारों के विवो चयन के लिए एएवी पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी की पीढ़ी के लिए निर्णायक चरणों का वर्णन करते हैं, इसके बाद विवो स्क्रीनिंग में माध्यमिक के लिए सबसे दिलचस्प कैप्सिड वेरिएंट को बारकोड करने का प्रदर्शन करते हैं। इसके बाद, हम एनजीएस डेटा विश्लेषण के दौरान सबसे महत्वपूर्ण चरणों के अवलोकन के साथ निष्कर्ष निकालने से पहले, बारकोड प्रवर्धन और एडाप्टर लिगेशन सहित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) के लिए पुस्तकालयों के निर्माण के लिए पद्धति का उदाहरण देते हैं। चूंकि यहां बताए गए प्रोटोकॉल बहुमुखी और अनुकूलनीय हैं, शोधकर्ता आसानी से अपने पसंदीदा रोग मॉडल में और जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए इष्टतम एएवी कैप्सिड वेरिएंट को समृद्ध करने के लिए उनका उपयोग कर सकते हैं।
जीन ट्रांसफर थेरेपी कोशिकाओं में आनुवंशिक सामग्री की शुरुआत है जो बीमारी को रोकने, इलाज, इलाज या सुधारने के लिए सेलुलर आनुवंशिक सामग्री की मरम्मत, प्रतिस्थापन या परिवर्तन करती है। जीन स्थानांतरण, विवो और एक्स विवो दोनों में, विभिन्न वितरण प्रणालियों, गैर-वायरल और वायरल पर निर्भर करता है। वायरस अपने लक्ष्य कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक ट्रांसड्यूस करने के लिए स्वाभाविक रूप से विकसित हुए हैं और इसका उपयोग वितरण वैक्टर के रूप में किया जा सकता है। जीन थेरेपी में नियोजित विभिन्न प्रकार के वायरल वैक्टर के बीच, एडेनो से जुड़े वायरस का तेजी से उपयोग किया गया है, रोगजनकता, सुरक्षा, कम इम्युनोजेनेसिटी की कमी के कारण, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि दीर्घकालिक, गैर-एकीकृत अभिव्यक्ति 1,2,3 को बनाए रखने की उनकी क्षमता है। एएवी जीन थेरेपी ने पिछले दशक में काफी उपलब्धियां हासिल की हैं; मनुष्यों में उपयोग के लिए यूरोपीय मेडिसिन एजेंसी और यूएस फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन द्वारा तीन उपचारों को मंजूरी दी गई है। विभिन्न प्रकार की बीमारियों, जैसे हीमोफिलिया, मांसपेशियों, हृदय और न्यूरोलॉजिकल रोगों के इलाज के लिए कई नैदानिक परीक्षण भी चल रहे हैं, जैसा कि कहीं और समीक्षा की गईहै। दशकों की प्रगति के बावजूद, जीन थेरेपी के क्षेत्र ने हाल के वर्षों में असफलताओं की एक श्रृंखला का अनुभव किया है, सबसे महत्वपूर्ण रूप से नैदानिक परीक्षणों5 में मौतें जिन्हें खुराक-सीमित विषाक्तताओं के कारण रोक दिया गया है, विशेष रूप से ऊतकों के लिए जो बड़े पैमाने पर हैं, जैसे कि मांसपेशी, या पहुंचना मुश्किल है, जैसे कि मस्तिष्क6।
वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों में उपयोग किए जा रहे एएवी वैक्टर कुछ अपवादों के साथ प्राकृतिक सीरोटाइप सेसंबंधित हैं। एएवी इंजीनियरिंग बेहतर अंग- या सेल-विशिष्टता और दक्षता के साथ वैक्टर विकसित करने का अवसर प्रदान करता है। पिछले दो दशकों में, पेप्टाइड डिस्प्ले, लूप-स्वैप, कैप्सिड डीएनए फेरबदल, त्रुटि-प्रवण पीसीआर और लक्षित डिजाइन जैसे कई दृष्टिकोणों को सफलतापूर्वक लागू किया गया है, ताकि अलग-अलग एएवी वेरिएंट या विभिन्न गुणों वाले पुस्तकालयों को उत्पन्नकिया जा सके। फिर इन्हें वांछित गुणों के साथ उनके भीतर वेरिएंट का चयन करने के लिए निर्देशित विकास के कई दौरों के अधीन किया जाता है, जैसा कि कहीं और समीक्षा कीगई है। सभी कैप्सिड विकास रणनीतियों में से, पेप्टाइड डिस्प्ले एएवी पुस्तकालयों का सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, कुछ अद्वितीय गुणों के कारण: वे उत्पन्न करने में अपेक्षाकृत आसान हैं, और वे उच्च विविधता और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्राप्त कर सकते हैं, जो उनके विकास को पीछे छोड़ने की अनुमति देता है।
पहला सफल पेप्टाइड सम्मिलन एएवी पुस्तकालयों को लगभग 20 साल पहले वर्णित किया गया था। पहले में से एक में, पेराबो एट अल.8 ने संशोधित एएवी 2 कैप्सिड्स की एक लाइब्रेरी का निर्माण किया, जिसमें यादृच्छिक रूप से उत्पन्न ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का एक पूल एक प्लास्मिड में एक ऐसी स्थिति में डाला गया था जो वीपी 1 कैप्सिड प्रोटीन के एमिनो-एसिड 587 से मेल खाती है, कैप्सिड से निकलने वाली तीन गुना धुरी में। एडेनोवायरस सह-संक्रमण का उपयोग करते हुए, एएवी लाइब्रेरी को चयन के कई दौरों के माध्यम से विकसित किया गया था, और अंतिम पुन: लक्षित वेरिएंट को माता-पिता के एएवी 28 के लिए सेल लाइनों को अपवर्तक ट्रांसड्यूस करने में सक्षम दिखाया गया था। इसके तुरंत बाद, मुलर एट अल.9 ने पुस्तकालय उत्पादन के लिए दो-चरणीय प्रणाली पेश की, प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण सुधार। प्रारंभ में, प्लास्मिड लाइब्रेरी, एक एडेनोवायरल हेल्पर प्लास्मिड के साथ, एक एएवी लाइब्रेरी का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है जिसमें चिमेरिक कैप्सिड होते हैं। इस एएवी शटल लाइब्रेरी का उपयोग संक्रमण की कम बहुलता (एमओआई) पर कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए किया जाता है, जिसका उद्देश्य प्रति सेल एक वायरल जीनोम पेश करना है। एडेनोवायरस के साथ सह-संक्रमण एक मिलान जीनोम और कैप्सिड 9 के साथ एएवी के उत्पादन को सुनिश्चित करताहै। लगभग एक दशक बाद, 7 एम 8 संस्करण बनाने के लिए विवो निर्देशित विकास में उपयोग किए गए दलकारा10। इस संस्करण में 10 एमिनो-एसिड सम्मिलन (LALGETTRPA) है, जिनमें से तीन लिंकर के रूप में कार्य करते हैं, और इंट्राविट्रल इंजेक्शन10 के बाद बाहरी रेटिना को कुशलतापूर्वक लक्षित करते हैं। यह इंजीनियर कैप्सिड एक असाधारण सफलता की कहानी है, क्योंकियह क्लिनिक में इसे बनाने के लिए कुछ इंजीनियर कैप्सिड्स में से एक है।
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) तकनीकों की शुरूआत के साथ क्षेत्र ने दूसरा बढ़ावा दिया। 2014 में अडाची एट अल.12 और 2015 में मार्सिक एट अल.13 के दो प्रकाशनों ने उच्च सटीकता के साथ बारकोडेड एएवी कैप्सिड पुस्तकालयों के वितरण को ट्रैक करने के लिए एनजीएस की शक्ति का प्रदर्शन किया। कुछ साल बाद, बारकोडेड क्षेत्रों के एनजीएस को कैप्सिड विकास का पालन करने के लिए पेप्टाइड सम्मिलन क्षेत्र के लिए अनुकूलित किया गया था। कोर्बेलिन एट अल .14 ने फुफ्फुसीय-लक्षित एएवी 2-आधारित कैप्सिड की पहचान करने के लिए एक एनजीएस-निर्देशित स्क्रीनिंग का प्रदर्शन किया। एनजीएस विश्लेषण ने तीन रेटिंग स्कोर की गणना करने में मदद की: चयन राउंड के बीच संवर्धन स्कोर, ऊतक विशिष्टता निर्धारित करने के लिए सामान्य विशिष्टता स्कोर, और अंत में संयुक्त स्कोर14। ग्रैडिनारू लैब15 ने उसी वर्ष क्रे-पुनर्संयोजन-आधारित एएवी लक्षित विकास (क्रिएट) प्रणाली प्रकाशित की, जो सेल-प्रकार-विशिष्ट चयन की सुविधा प्रदान करती है। इस प्रणाली में, कैप्सिड लाइब्रेरी में एक क्रे-इनवर्टिबल स्विच होता है, क्योंकि पॉलीए सिग्नल दो लॉक्सपी साइटों से घिरा होता है। एएवी लाइब्रेरी को तब क्रे चूहों में इंजेक्ट किया जाता है, जहां पॉलीए सिग्नल केवल सीआरई + कोशिकाओं में उल्टा होता है, जो कैप्सिड जीन के भीतर फॉरवर्ड प्राइमर के साथ रिवर्स पीसीआर प्राइमर के बंधन के लिए टेम्पलेट प्रदान करता है। इस अत्यधिक विशिष्ट पीसीआर बचाव ने एएवी-पीएचपी की पहचान को सक्षम किया। बी संस्करण जो रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करसकता है 15. इस प्रणाली को आगे एम-क्रिएट (मल्टीप्लेक्स-क्रिएट) में विकसित किया गया था, जिसमें एनजीएस और सिंथेटिक लाइब्रेरी उत्पादन को पाइपलाइन16 में एकीकृत किया गया था।
मैगुइरे लैब17, आईट्रांसड्यूस से इस प्रणाली का एक बेहतर आरएनए-आधारित संस्करण, कैप्सिड्स के डीएनए स्तर पर चयन की अनुमति देता है जो कार्यात्मक रूप से कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करते हैं और उनके जीनोम को व्यक्त करते हैं। पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी के वायरल जीनोम में एक सर्वव्यापी प्रमोटर के नियंत्रण में एक सीआरई जीन और पी 41 प्रमोटर के नियंत्रण में कैप्सिड जीन शामिल है। पुस्तकालय को चूहों में इंजेक्ट किया जाता है जिनके पास टीडीटोमेटो के अपस्ट्रीम में एक लोक्सपी-स्टॉप-लॉक्सपी कैसेट होता है। कोशिकाओं को एएवी वेरिएंट के साथ ट्रांसड्यूस किया जाता है जो वायरल जीनोम को व्यक्त करते हैं और इसलिए सीआरई एक्सप्रेस टीडीटोमेटो और सेल मार्करों के साथ संयोजन में, क्रमबद्ध और चयनित किया जा सकताहै। इसी तरह, नोनेनमेकर एट अल.18 और टैबेबोर्डबार एट अल.19 ने कैप्सिड जीन लाइब्रेरी को ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण में रखा। विभिन्न पशु मॉडल में इंजेक्शन के बाद, वायरल आरएनए का उपयोग कैप्सिड वेरिएंट को अलग करने के लिए किया गया था।
एक वैकल्पिक दृष्टिकोण कैप्सिड पुस्तकालयों को टैग करने के लिए बारकोडिंग का उपयोग करना है। ब्योर्कलुंड लैब20 ने बारकोड पेप्टाइड सम्मिलन कैप्सिड पुस्तकालयों के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग किया और बारकोडेड तर्कसंगत एएवी वेक्टर विकास (ब्रेव) विकसित किया। एक प्लास्मिड में, रेप 2कैप कैसेट को उल्टे टर्मिनल रिपीट (आईटीआर) -फ्लैंक्ड, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) -व्यक्त, बारकोड-टैग किए गए ट्रांसजीन के बगल में क्लोन किया जाता है। कैप के अंत और बारकोड की शुरुआत के बीच लोक्सपी साइटों का उपयोग करते हुए, एक इन विट्रो सीआरई पुनर्संयोजन एनजीएस के लिए पर्याप्त छोटा टुकड़ा उत्पन्न करता है, जिससे अद्वितीय बारकोड (लुक-अप टेबल, एलयूटी) के साथ पेप्टाइड सम्मिलन के जुड़ाव की अनुमति मिलती है। एएवी उत्पादन प्लास्मिड लाइब्रेरी का उपयोग करके किया जाता है और एमआरएनए में व्यक्त बारकोड को विवो एप्लिकेशन में फिर से एनजीएस20 के साथ जांचा जाता है। जब कैप्सिड पुस्तकालयों में पूरे कैप्सिड जीन (यानी, फेरबदल पुस्तकालय) के रूप शामिल होते हैं, तो लंबे समय तक पढ़ने वाले अनुक्रमण का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। कई समूहों ने इन विविध पुस्तकालयों को टैग करने के लिए बारकोड का उपयोग किया है, जो एनजीएस को उच्च पढ़ने की गहराई के साथ सक्षम बनाता है। केए लैब21 ने कैप पॉलीए सिग्नल के डाउनस्ट्रीम बारकोड के साथ अत्यधिक विविध कैप्सिड फेरबदल पुस्तकालयों को टैग किया। पहले चरण में, एक बारकोडेड प्लास्मिड लाइब्रेरी उत्पन्न की गई थी, और फेरबदल कैप्सिड जीन लाइब्रेरी को इसमें क्लोन किया गया था। फिर उनके एलयूटी21 को उत्पन्न करने के लिए मिसेक (लघु पठन, उच्च पठन गहराई) और पीएसीबायो (लंबे समय तक पढ़ने, कम पढ़ने की गहराई) एनजीएस के साथ-साथ सेंगर अनुक्रमण के संयोजन का उपयोग किया गया था। 2019 में, ओग्डेन और चर्च लैब22 के सहयोगियों ने पुस्तकालयों का उपयोग करके कई कार्यों के लिए एएवी 2 कैप्सिड फिटनेस को चित्रित किया, जिसमें हर स्थिति में एकल बिंदु उत्परिवर्तन, सम्मिलन और विलोपन थे, जिसने अंततः मशीन-निर्देशित डिजाइन को सक्षम किया। लाइब्रेरी की पीढ़ी के लिए, कैप्सिड जीन के छोटे टुकड़ों को संश्लेषित किया गया, एक बारकोड के साथ टैग किया गया, अगली पीढ़ी के अनुक्रम, और फिर पूर्ण कैप्सिड जीन में क्लोन किया गया। एनजीएस डेटा का उपयोग एलयूटी उत्पन्न करने के लिए किया गया था। लाइब्रेरी को तब केवल बारकोड और शॉर्ट रीड सीक्वेंसिंग का उपयोग करके स्क्रीन किया गया था, जो बदले में उच्च पठन गहराई22 की अनुमति देता है।
बारकोडेड पुस्तकालयों का उपयोग मुख्य रूप से कैप्सिड पुस्तकालयों के चयन के कई दौर के बाद या कैप्सिड विकास अध्ययन से स्वतंत्र ज्ञात, प्राकृतिक और इंजीनियर वेरिएंट के पूल को स्क्रीन करने के लिए किया गया है। ऐसे पुस्तकालयों का लाभ जानवरों की संख्या को कम करने और जानवरों के बीच भिन्नता को कम करते हुए, कई कैप्सिड्स को स्क्रीन करने का अवसर है। एएवी क्षेत्र में इस तकनीक को पेश करने वाले पहले अध्ययन लगभग एक दशक पहले प्रकाशित हुए थे। नकई लैब12 ने 12-न्यूक्लियोटाइड बारकोड की एक जोड़ी के साथ एएवी 9 से वीपी 1 पर अमीनो एसिड 356 से 736 को कवर करने वाले 191 डबल एलानिन उत्परिवर्ती को टैग किया। एनजीएस का उपयोग करते हुए, लाइब्रेरी को गैलेक्टोज बाइंडिंग और अन्य गुणों के लिए विवो में जांचकी गई थी। मार्सिक और उनके सहयोगियों ने 1 साल बाद13 के डबल-बारकॉर्डेड विश्लेषण का उपयोग करके एएवी वेरिएंट के जैव वितरण को चित्रित किया। गैर-मानव प्राइमेट्स में एक और हालिया अध्ययनने प्रसव के विभिन्न मार्गों का उपयोग करके 29 कैप्सिड्स के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में जैव वितरण की तुलना की। हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में 183 वेरिएंट के बारकोडेड एएवी लाइब्रेरी स्क्रीन प्रकाशित किए हैं जिनमें प्राकृतिक और इंजीनियर एएवी शामिल हैं। डीएनए और आरएनए स्तर पर इन स्क्रीनों ने चूहों में एक अत्यधिक मायोट्रोपिक एएवी संस्करण24 की पहचान की और साथ ही माउस मस्तिष्क25 में एक उच्च सेल-प्रकार विशिष्टता प्रदर्शित की।
यहां, हम इस काम में उपयोग की जाने वाली पद्धति का वर्णन करते हैं और एएवी पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग को शामिल करने के लिए इसका विस्तार करते हैं। इसमें एएवी 2 पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी, परिमाणीकरण के लिए एक डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) विधि और अंत में एएवी वेरिएंट का विश्लेषण करने के लिए एक एनजीएस पाइपलाइन शामिल है, जो वेनमैन और सहयोगियों24 द्वारा किए गए काम पर आधारित है। अंत में, बारकोडेड एएवी पुस्तकालयों की पीढ़ी और एक ही प्रकाशन में उपयोग की जाने वाली एनजीएस पाइपलाइन का विवरण प्रदान किया गया है।
इस प्रोटोकॉल में, पेप्टाइड डिस्प्ले एएवी कैप्सिड इंजीनियरिंग और बारकोडेड एएवी लाइब्रेरी स्क्रीनिंग के साथ-साथ लाइब्रेरी संरचना और कैप्सिड प्रदर्शन के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के लिए आवश्यक चरणो?…
The authors have nothing to disclose.
डी.जी. जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) द्वारा डीएफजी सहयोगी अनुसंधान केंद्रों एसएफबी 1129 (प्रोजेक्तनुमर 240245660) और टीआरआर 179 (प्रोजेक्तनुमर 272983813) के साथ-साथ जर्मन सेंटर फॉर इंफेक्शन रिसर्च (डीजेडआईएफ, बीएमबीएफ) द्वारा समर्थन की बहुत सराहना करता है; टीटीयू-एचआईवी 04.819)।
Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |