Aislamiento de vectores de terapia génica de próxima generación a través de ingeniería, códigos de barras y detección de variantes de cápside del virus adenoasociado (AAV)
Summary
Generación de la biblioteca de visualización de péptidos AAV y posterior validación a través del código de barras de candidatos con propiedades novedosas para la creación de AAV de próxima generación.
Abstract
Los vectores de entrega de genes derivados del virus adenoasociado (AAV) son una de las herramientas más prometedoras para el tratamiento de enfermedades genéticas, evidenciada por el fomento de datos clínicos y la aprobación de varias terapias génicas AAV. Dos razones principales para el éxito de los vectores AAV son (i) el aislamiento previo de varios serotipos virales naturales con propiedades distintas, y (ii) el posterior establecimiento de tecnologías poderosas para su ingeniería molecular y reutilización en alto rendimiento. Impulsando aún más el potencial de estas técnicas se han implementado recientemente estrategias para codificar cápsides AAV seleccionadas a nivel de ADN y ARN, lo que permite su estratificación in vivo completa y paralela en todos los órganos principales y tipos de células en un solo animal. Aquí, presentamos una tubería básica que abarca este conjunto de vías complementarias, utilizando la visualización de péptidos AAV para representar el diverso arsenal de tecnologías de ingeniería de cápside disponibles. En consecuencia, primero describimos los pasos fundamentales para la generación de una biblioteca de visualización de péptidos AAV para la selección in vivo de candidatos con las propiedades deseadas, seguido de una demostración de cómo codificar las variantes de cápside más interesantes para el cribado secundario in vivo. A continuación, ejemplificamos la metodología para la creación de bibliotecas para la secuenciación de próxima generación (NGS), incluida la amplificación de códigos de barras y la ligadura de adaptadores, antes de concluir con una descripción general de los pasos más críticos durante el análisis de datos NGS. Como los protocolos informados aquí son versátiles y adaptables, los investigadores pueden aprovecharlos fácilmente para enriquecer las variantes óptimas de la cápside AAV en su modelo de enfermedad favorito y para aplicaciones de terapia génica.
Introduction
La terapia de transferencia de genes es la introducción de material genético en las células para reparar, reemplazar o alterar el material genético celular para prevenir, tratar, curar o mejorar la enfermedad. La transferencia de genes, tanto in vivo como ex vivo, se basa en diferentes sistemas de administración, no virales y virales. Los virus han evolucionado naturalmente para transducir eficientemente sus células diana y pueden ser utilizados como vectores de entrega. Entre los diferentes tipos de vectores virales empleados en la terapia génica, los virus adenoasociados se han utilizado cada vez más, debido a su falta de patogenicidad, seguridad, baja inmunogenicidad y, lo que es más importante, su capacidad para mantener la expresión no integradora a largo plazo 1,2,3. La terapia génica AAV ha producido logros considerables en la última década; tres terapias han sido aprobadas por la Agencia Europea de Medicamentos y la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para su uso en humanos 3,4. También se están realizando varios ensayos clínicos para tratar una variedad de enfermedades, como la hemofilia, las enfermedades musculares, cardíacas y neurológicas, como se revisó en otra parte3. A pesar de décadas de avances, el campo de la terapia génica ha experimentado una serie de reveses en los últimos años4, sobre todo muertes en ensayos clínicos5 que se han suspendido debido a las toxicidades limitantes de la dosis, particularmente para tejidos que son masivos, como los músculos, o difíciles de alcanzar, como el cerebro6.
Los vectores AAV que se utilizan actualmente en ensayos clínicos pertenecen a los serotipos naturales con algunas excepciones1. La ingeniería AAV ofrece la oportunidad de desarrollar vectores con una especificidad y eficiencia superior de órganos o células. En las últimas dos décadas, se han aplicado con éxito varios enfoques, como la visualización de péptidos, el intercambio de bucles, la mezcla de ADN de la cápside, la PCR propensa a errores y el diseño dirigido, para generar variantes individuales de AAV o bibliotecas de las mismas con diversas propiedades7. Estos se someten a múltiples rondas de evolución dirigida para seleccionar las variantes dentro de ellos con las propiedades deseadas, como se revisa en otra parte 1,3. De todas las estrategias de evolución de la cápside, las bibliotecas AAV de visualización de péptidos han sido las más utilizadas, debido a algunas propiedades únicas: son relativamente fáciles de generar y pueden lograr una alta diversidad y una secuenciación de alto rendimiento, lo que permite seguir su evolución.
Las primeras bibliotecas AAV de inserción de péptidos exitosas se describieron hace casi 20 años. En uno de los primeros, Perabo et al.8 construyeron una biblioteca de cápsides AAV2 modificadas, en la que se insertó un conjunto de oligonucleótidos generados aleatoriamente en un plásmido en una posición que corresponde al aminoácido 587 de la proteína de la cápside VP1, en el eje triple que sobresale de la cápside. Utilizando la coinfección por adenovirus, la biblioteca AAV evolucionó a través de múltiples rondas de selección, y se demostró que las variantes finales redirigidas eran capaces de transducir líneas celulares refractarias al AAV2 parental8. Poco después, Müller et al.9 introdujeron el sistema de dos pasos para la producción bibliotecaria, una mejora significativa del protocolo. Inicialmente, la biblioteca de plásmidos, junto con un plásmido auxiliar adenoviral, se utilizan para producir una biblioteca AAV que contiene cápsides quiméricas. Esta biblioteca de lanzadera AAV se utiliza para infectar células a baja multiplicidad de infección (MOI), con el objetivo de introducir un genoma viral por célula. La coinfección con adenovirus asegura la producción de AAV con un genoma y una cápside9 coincidentes. Aproximadamente una década después, Dalkara10 utilizó la evolución dirigida in vivo para crear la variante de 7m8. Esta variante tiene una inserción de 10 aminoácidos (LALGETTRPA), tres de los cuales actúan como enlazadores, y se dirige eficientemente a la retina externa después de la inyección intravítrea10. Esta cápside diseñada es una historia de éxito excepcional, ya que es una de las pocas cápsides diseñadas para llegar a la clínica hasta ahora11.
El campo experimentó un segundo impulso con la introducción de técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS). Dos publicaciones de Adachi et al.12 en 2014 y de Marsic et al.13 en 2015, mostraron el poder de NGS para rastrear la distribución de bibliotecas de cápside AAV con código de barras con alta precisión. Unos años más tarde, la NGS de las regiones con código de barras se adaptó a la región de inserción de péptidos para seguir la evolución de la cápside. Körbelin et al.14 realizaron un cribado guiado por NGS para identificar una cápside basada en AAV2 dirigida a los pulmones. El análisis NGS ayudó a calcular tres puntajes de calificación: el puntaje de enriquecimiento entre las rondas de selección, el puntaje de especificidad general para determinar la especificidad del tejido y, finalmente, el puntaje combinado14. El laboratorio Gradinaru15 publicó el sistema de evolución dirigida AAV (CREATE) basado en la recombinación de Cre en el mismo año, que facilita una selección específica del tipo de célula. En este sistema, la biblioteca de cápside lleva un interruptor invertible Cre, ya que la señal polyA está flanqueada por dos sitios loxP. Luego, la biblioteca AAV se inyecta en ratones Cre, donde la señal de poliA se invierte solo en células Cre+, proporcionando la plantilla para la unión de un cebador de PCR inversa con el cebador directo dentro del gen de la cápside. Este rescate de PCR altamente específico permitió la identificación del AAV-PHP. Variante B que puede atravesar la barrera hematoencefálica15. Este sistema evolucionó aún más en M-CREATE (Multiplexed-CREATE), en el que NGS y la generación de bibliotecas sintéticas se integraron en la tubería16.
Una versión mejorada basada en ARN de este sistema del laboratorio17 de Maguire, iTransduce, permite la selección a nivel de ADN de cápsides que transducen funcionalmente células y expresan sus genomas. El genoma viral de la biblioteca de visualización de péptidos comprende un gen Cre bajo el control de un promotor ubicuo y el gen de la cápside bajo el control del promotor p41. La biblioteca se inyecta en ratones que tienen un casete loxP-STOP-loxP aguas arriba de tdTomato. Las células transducidas con variantes AAV que expresan el genoma viral y, por lo tanto, Cre expresan tdTomato y, en combinación con marcadores celulares, pueden clasificarse y seleccionarse17. Del mismo modo, Nonnenmacher et al.18 y Tabebordbar et al.19 colocaron la biblioteca de genes de la cápside bajo el control de promotores específicos de tejido. Después de la inyección en diferentes modelos animales, se utilizó ARN viral para aislar las variantes de la cápside.
Un enfoque alternativo es usar códigos de barras para etiquetar las bibliotecas de cápside. El laboratorio20 de Björklund utilizó este enfoque para las bibliotecas de cápside de inserción de péptidos de códigos de barras y desarrolló la evolución racional del vector AAV con código de barras (BRAVE). En un plásmido, el casete Rep2Cap se clona junto a un transgén marcado con código de barras que expresa repeticiones terminales invertidas (ITR) y que expresa proteínas fluorescentes amarillas (YFP). Utilizando sitios loxP entre el final de la tapa y el comienzo del código de barras, una recombinación de Cre in vitro genera un fragmento lo suficientemente pequeño para NGS, lo que permite la asociación de la inserción del péptido con el código de barras único (tabla de búsqueda, LUT). La producción de AAV se realiza utilizando la biblioteca de plásmidos y los códigos de barras expresados en el ARNm se examinan después de la aplicación in vivo , nuevamente con NGS20. Cuando las bibliotecas de cápside comprenden variantes de todo el gen de la cápside (es decir, bibliotecas barajadas), se debe utilizar la secuenciación de lectura larga. Varios grupos han utilizado códigos de barras para etiquetar estas diversas bibliotecas, lo que permite que NGS tenga una mayor profundidad de lectura. El laboratorio Kay21 etiquetó bibliotecas barajadas de cápside muy diversas con códigos de barras aguas abajo de la señal de poliA de la tapa . En un primer paso, se generó una biblioteca de plásmidos con código de barras, y la biblioteca de genes de la cápside barajada se clonó en ella. Luego se utilizó una combinación de MiSeq (lectura corta, mayor profundidad de lectura) y PacBio (lectura larga, menor profundidad de lectura), así como la secuenciación de Sanger para generar su LUT21. En 2019, Ogden y sus colegas del laboratorio Church22 delinearon la aptitud de la cápside AAV2 para múltiples funciones utilizando bibliotecas que tenían mutaciones, inserciones y eliminaciones de un solo punto en cada posición, lo que finalmente permitió el diseño guiado por máquina. Para la generación de la biblioteca, se sintetizaron fragmentos más pequeños del gen de la cápside, se marcaron con un código de barras, se secuenciaron de próxima generación y luego se clonaron en el gen completo de la cápside. Los datos de NGS se utilizaron para generar una LUT. Luego, la biblioteca se examinó utilizando solo los códigos de barras y la secuenciación de lectura corta, lo que a su vez permite una mayor profundidad de lectura22.
Las bibliotecas con código de barras se han utilizado predominantemente para examinar un conjunto de variantes conocidas, naturales y de ingeniería después de varias rondas de selección de bibliotecas de cápside o independientes de un estudio de evolución de la cápside. La ventaja de tales bibliotecas es la oportunidad de examinar múltiples cápsides, al tiempo que reduce el número de animales y minimiza la variación entre los animales. Los primeros estudios que introdujeron esta tecnología en el campo de AAV se publicaron hace casi una década. El laboratorio Nakai 12 etiquetó 191 mutantes de alanina doble que cubrían los aminoácidos 356 a 736 en el VP1 de AAV9 con un par de códigos de barras de12 nucleótidos. Utilizando NGS, la biblioteca fue examinada in vivo para la unión a galactosa y otras propiedades12. Marsic y sus colegas delinearon la biodistribución de las variantes de AAV utilizando también un análisis de doble barra 1 año después13. Un estudio más reciente en primates no humanos comparó la biodistribución en el sistema nervioso central de 29 cápsides utilizando diferentes vías de entrega23. Nuestro laboratorio ha publicado recientemente pantallas de biblioteca AAV con código de barras de 183 variantes que incluían AAV naturales y de ingeniería. Estas pantallas a nivel de ADN y ARN condujeron a la identificación de una variante AAV24 altamente miotrópica en ratones, así como otras que muestran una alta especificidad de tipo celular en el cerebro del ratón25.
Aquí, describimos la metodología utilizada en este trabajo y la ampliamos para incluir la detección de las bibliotecas de visualización de péptidos AAV. Esto comprende la generación de bibliotecas de visualización de péptidos AAV2, un método de PCR digital de gotas (dd-PCR) para la cuantificación y, finalmente, una tubería NGS para analizar las variantes de AAV, basada en parte en el trabajo de Weinmann y colegas24. Finalmente, se proporciona una descripción de la generación de bibliotecas AAV con código de barras y la canalización NGS utilizada en la misma publicación.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se describen los pasos necesarios para la ingeniería de la cápside AAV de visualización de péptidos y para la detección de bibliotecas AAV con código de barras, así como para el análisis bioinformático de la composición de la biblioteca y el rendimiento de la cápside. Este protocolo se centra en los pasos que facilitan el análisis bioinformático de este tipo de bibliotecas, porque la mayoría de los laboratorios de virología están rezagados en las habilidades de programación para que co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G. agradece enormemente el apoyo de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a través de los Centros de Investigación Colaborativa DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) y TRR179 (Projektnummer 272983813), así como del Centro Alemán para la Investigación de Infecciones (DZIF, BMBF; TTU-VIH 04.819).
Materials
| Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
| BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
| BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
| β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
| BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
| dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
| DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
| Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
| E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
| Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
| GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
| ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
| Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
| MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
| Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
| PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
| Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
| ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
| Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
| Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
| pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
| Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
| Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
| QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
| rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
| rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
| SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
| 5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
| TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
| T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
| TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
| YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
| YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
| YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |
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