Summary
여기에서 우리는 T 세포 참여 이중특이적 항체의 항종양 효능 및 메커니즘을 평가하기 위한 연구에서 종양에 대한 이중특이적 항체 유도 T 세포 이동의 생체 내 추적을 용이하게 하기 위해 인간 T 세포를 루시페라아제로 형질도입하는 방법을 설명합니다.
Abstract
T 세포 참여 이중특이성 항체(T-BsAbs)는 고형 종양에 대한 전임상 개발 및 임상 시험의 다양한 단계에 있습니다. 원자가, 공간 배열, 도메인 간 거리 및 Fc 돌연변이와 같은 요인은 일반적으로 T 세포가 종양으로 귀환하는 데 영향을 미침으로써 이러한 치료법의 항종양 효능에 영향을 미치며, 이는 여전히 주요 과제로 남아 있습니다. 여기에서는 활성화된 인간 T 세포를 루시페라아제로 형질도입하여 T-BsAb 요법 연구 동안 T 세포를 생체 내 추적할 수 있는 방법을 설명합니다. T 세포를 종양으로 리디렉션하는 T-BsAbs의 능력은 치료 중 여러 시점에서 정량적으로 평가될 수 있으므로 연구자들은 T-BsAb의 항종양 효능 및 기타 개입을 종양에서 T 세포의 지속성과 연관시킬 수 있습니다. 이 방법은 T 세포 침윤을 조직학적으로 평가하기 위해 치료 동안 동물을 희생할 필요성을 완화하고, 치료 중 및 치료 후에 T 세포 밀매의 동역학을 결정하기 위해 여러 시점에서 반복될 수 있습니다.
Introduction
T 세포 참여 이중특이적 항체(T-BsAbs)는 하나의 결합 아암을 통해 T 세포를 결합시키고 다른 결합 아암을 통해 종양 항원을 결합시킴으로써 다클론 T 세포에 인공 특이성을 제공하는 데 사용되는 조작된 항체입니다. 이 기술은 혈액암(CD19 표적 블리나투모맙1)에 성공적으로 적용되었으며, 수많은 T-BsAb가 다양한 고형 종양에 대한 전임상 및 임상 개발 중에 있습니다2. T-BsAbs는 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 무관한 방식으로 다클론 T 세포에 관여하므로 인간 백혈구 항원(HLA)을 하향 조절하는 종양도 이러한 유형의 치료에 취약합니다 3,4. T-BsAbs는 T 세포와 종양 결합군의 원자가 및 공간 배열, 도메인 간 거리, 반감기에 영향을 미치고 존재하는 경우 이펙터 기능을 유도할 수 있는 Fc 도메인의 포함에 차이가 있는 수십 가지 다양한 형식으로 개발되었다5. 본 연구실의 이전 연구에서는 이러한 요인들이 T-BsAb의 항종양 효능에 상당한 영향을 미치며, 효능 차이는 최대 1,000배에 달하는 것으로 나타났다6. 이 작업을 통해 우리는 IgG-[L]-scFv 형식이 T-BsAb에 이상적인 플랫폼임을 확인했으며(T-BsAb 형식에 대한 자세한 내용은 대표 결과 섹션 참조), 이 플랫폼을 GD2(신경모세포종), HER2(유방암 및 골육종), GPA33(결장직장암), STEAP1(유잉 육종), CD19(B 세포 악성 종양) 및 CD33(B 세포 악성 종양)7, 8,9,10,11,12,13.
고형 종양에서 T-BsAb 요법을 성공적으로 시행하기 위한 주요 과제 중 하나는 면역억제 종양 미세환경(TME)을 극복하여 종양으로의 T 세포 이동을 유도하는 것입니다14. 상술한 T-BsAb 효능에 영향을 미치는 인자는 종양에 대한 T 세포 귀환을 효과적으로 유도하는 T-BsAb의 능력에 상당한 영향을 미치지만, 이 효과는 생체 내 시스템에서 실시간으로 평가하기 어렵다. 이 원고는 치료 중 실험적 면역저하 마우스 모델에서 다양한 조직으로의 T 세포 이동을 평가하기 위해 T-BsAb의 전임상 연구에서 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 사용에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 치료 중 동물을 희생할 필요 없이 종양 및 기타 조직에서 T 세포 침윤을 평가할 수 있는 수단뿐만 아니라 T 세포 귀환 동역학 및 지속성에 대한 실시간 통찰력을 제공하는 것입니다. 세포 면역 요법에 중점을 둔 연구자의 수가 증가함에 따라 전임상 동물 모델에서 생체 내에서 T 세포를 추적하는 능력이 중요합니다. 우리는 다른 연구자들이 이 기술을 쉽게 복제할 수 있도록 루시페라아제 형질도입 T 세포를 추적하기 위해 사용한 방법에 대한 철저하고 상세한 설명을 제공하는 것을 목표로 합니다.
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Protocol
다음 절차는 Memorial Sloan Kettering의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 평가하고 승인했습니다.
1. 루시페라아제를 이용한 293T 세포의 형질주입 및 바이러스 상청액 수확
- 293T 세포의 배양
- 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS) 110mL, 페니실린-스트렙토마이신 11mL를 각각 1리터의 DMEM에 추가하여 배지를 준비합니다.
- 5 x 106 293T 세포를 해동하고, 상기와 같이 제조된 배지와 함께 T175 플라스크에 옮긴다.
- 293T 세포를 6일 동안 3일마다 1:10으로 분할합니다. 세포가 90 % 이상 합류하지 않도록하십시오.
- 293T 세포의 형질주입
참고: 293T 세포의 T175 플라스크 1개를 형질주입하기 위해 다음의 시약 수량을 계산합니다. 더 많은 플라스크를 변환해야 하는 경우 그에 따라 조정하십시오.- 피펫을 사용하여 1.5mL의 배지를 두 개의 50mL 튜브 각각에 옮깁니다. 하나의 튜브에 VSV-G 플라스미드 10μg, Gag/pol 20μg, 딱정벌레 레드 TD 토마토(CBR-TDR) 루시페라아제 플라스미드 20μg을 넣고 혼합합니다. 다른 튜브에 100 μL의 DNA in vitro transfection 시약을 넣고 혼합합니다. 두 튜브를 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
참고: 이 원고에 설명된 모든 플라스미드는 Vladimir Ponomarev 박사가 제공했습니다. - 시험 관내 형질주입 시약을 함유하는 배지를 DNA 플라스미드가 들어있는 튜브에 적가하고(약 30초에 걸쳐) 피펫으로 부드럽게 혼합한다. RT에서 20분 동안 배양합니다.
- 이 20분 배양 동안 0.05% 트립신 5-10mL를 첨가하여 293T 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 10mL의 배지와 800 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 추가합니다. 1.5mL의 배지에 세포를 재현탁합니다.
- DNA 시험 관내 형질주입 시약 및 DNA 플라스미드를 함유하는 배지를 293T 세포에 첨가하고, 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- T175 플라스크로 옮기고 18mL의 배지를 추가합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 다음날, 세포를 분리하지 않고 유리 피펫으로 배지를 조심스럽게 흡인하십시오. 18mL의 새 배지로 교체합니다. 인큐베이터에서 하룻밤 동안 37°C에서 배양합니다.
- 피펫을 사용하여 1.5mL의 배지를 두 개의 50mL 튜브 각각에 옮깁니다. 하나의 튜브에 VSV-G 플라스미드 10μg, Gag/pol 20μg, 딱정벌레 레드 TD 토마토(CBR-TDR) 루시페라아제 플라스미드 20μg을 넣고 혼합합니다. 다른 튜브에 100 μL의 DNA in vitro transfection 시약을 넣고 혼합합니다. 두 튜브를 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
- 바이러스 상청액 수확
- 얼음 위에 놓인 피펫을 사용하여 바이러스 상청액을 제거합니다. 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 파편을 펠릿화합니다.
참고: 세포 펠릿이 크면 상층액을 제거할 때 플라스크에서 세포가 파열되었을 가능성이 있습니다. 이 세포는 새로운 플라스크에서 새로운 배지로 다시 도금 할 수 있습니다. - 0.22 μm 필터를 사용하여 바이러스 상청액을 여과합니다.
- 바이러스 상청액을 즉시 사용하십시오. 얼음 또는 4°C에서 최대 24시간 동안 보관하거나 -80°C에서 냉동하여 장기간 보관할 수 있습니다.
- 얼음 위에 놓인 피펫을 사용하여 바이러스 상청액을 제거합니다. 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 파편을 펠릿화합니다.
2. 루시페라아제를 이용한 활성화된 인간 T 세포의 확장 및 형질도입
- 시험관 내에서 인간 T 세포의 활성화
- 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)과 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS) 10mL를 멸균된 15mL 튜브에 첨가하여 비드를 세척하고, 비드(T 세포 2개당 비드 1개)를 추가하고, 자석 랙에 2분 동안 넣고, PBS를 흡입 꺼냈다.
- 1.1.1 단계에 설명 된대로 배지를 준비한 다음 IL-2를 최종 농도 30 IU / mL에 추가하고 세척 된 비드를 추가합니다. T 세포 200만 개당 2.5mL의 배지를 만들어 활성화합니다.
- T 세포 (갓 정제된 또는 이전에 정제된, 냉동, 해동, 및 세척된)를 혈구계 및 트리판 블루 염색을 사용하여 계수한다. 단계 2.1.2에서 제조된 배지에 T 세포를 첨가하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합한다. T 세포는 세포의 출처 및 일반적인 건강 상태에 따라 최소 20배 확장됩니다. 마우스를 치료하는데 필요한 개수를 계산하고 20개로 나누어 활성화할 T 세포의 수를 결정한다. 여기서, 마우스당 20 x 106 T 세포를 예비 실험에 기초하여 사용하였다.
- 24-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 200만 T 세포, 비드 및 IL-2를 함유하는 배지 2.5mL를 플레이트에 넣었다. 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.
- 다음 3일 동안 매일 20x 현미경으로 T 세포를 검사하여 루시페라아제로 형질도입할 시기를 결정합니다. 세포가 함께 뭉쳐서 배지를 고갈시켜 빨간색/분홍색에서 밝은 주황색으로 변할 때 준비가 된 것입니다.
- 레트로넥틴 플레이트의 제조
참고: Retronectin은 유전자 형질도입을 향상시키기 때문에 형질도입에 사용되는 플레이트를 코팅하는 데 사용됩니다15.- PBS에 20μg/mL 레트로넥틴 2mL를 처리되지 않은 6웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 실온에서 2시간 또는 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 하나의 레트로넥틴-코팅된 웰은 200만 개의 T 세포가 형질도입될 때마다 필요하다.
- 플레이트 바닥을 긁지 않고 retronectin을 흡인하십시오.
- 6-웰 플레이트에 웰 당 PBS(멸균 여과)에 2% BSA 3mL를 추가합니다. RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 스피노툼
- 플레이트 바닥을 긁지 않고 BSA를 흡인합니다.
- 웰 당 3 mL의 PBS로 웰을 한 번 세척한다. 계속 또는 새로운 PBS로 교체하고 플레이트를 4°C에서 밤새 덮어 두십시오.
- 웰당 2mL의 CBR-TDR 루시페라아제 바이러스 상청액(1.3단계에서 수집)을 추가합니다.
- 32°C에서 90분 동안 1,240 x g 로 원심분리합니다.
- 변환
- T 세포를 셉니다.
- 플레이트 바닥을 긁지 않고 바이러스 상청액을 흡인합니다.
- 30 IU/mL 인간 IL-2를 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 6 mL에서 웰당 200만 개의 T 세포를 플레이트합니다.
- 매일 T 세포를 검사하십시오. T 세포는 거의 합류할 때, 보통 2일 후에 확장될 준비가 되어 있습니다.
- 세포가 거의 융합되면 피펫을 사용하여 플레이트 바닥에서 부드럽게 씻어내고 각 웰을 별도의 T75 플라스크로 옮깁니다. 9mL의 배지를 추가하여 플라스크당 총 15mL의 배지를 만듭니다.
- 다음 날 배지 15mL를 더 추가합니다. 세포는 배지를 첨가한 다음 날 생쥐에 주입할 준비가 되어 있어야 합니다. 유세포 분석을 수행하여 성공적인 형질도입을 확인합니다(루시페라아제 구조에는 PE 채널에서 볼 수 있는 TD 토마토 형광단이 포함되어 있음)16.
3. 면역저하 마우스에서 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 생착
- 주입을 위해 T 세포를 준비하고 계수합니다.
- 플라스크에서 T 세포를 제거하고 계산합니다. 세포는 일반적으로 활성화 후 7일째에 20x-30x 확장되면 주입할 준비가 됩니다.
- T 세포를 800 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 2mL의 배지에 재현탁하고 자석 랙을 사용하여 비드를 제거합니다.
- T 세포가 이중특이적 항체와 별도로 주입되는 실험의 경우, T 세포를 계수하고 최종 농도가 배지 100μL당 2,000만 T 세포가 되도록 재현탁합니다. 3.2단계로 건너뜁니다. 생체 외 무장 T 세포(EAT)를 사용한 실험의 경우 3.1.4단계로 건너뜁니다.
- 생체 외 무장 T 세포를 사용한 실험의 경우, T 세포를 세고 각 그룹마다 개별 1.5mL 튜브로 분리하여 마우스당 2,000만 개의 세포를 사용합니다. 예를 들어, 각각 5마리의 마우스로 구성된 3개의 그룹이 있는 경우 각각 1억 개의 T 세포가 있는 3개의 1.5mL 튜브를 준비합니다.
- 1.5mL 튜브를 800 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. T 세포 펠릿을 방해하지 않고 매체를 조심스럽게 제거합니다. 이중특이적 항체를 포함하는 배지 50μL 이하에서 재현탁합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 이 연구에서 수행된 실험의 목적을 위해 실험실에서 생성된 독점적인 IgG-[L]-scFv T 세포 결합 이중특이적 항체가 사용되었습니다. T 세포 준비를 위해, 20 x 106 T 세포 당 5 μg의 항체를 사용한다. 시판되는 이중특이적 항체도 사용할 수 있다. - 각 튜브에 1,450μL의 배지를 추가하여 과잉 항체를 씻어냅니다. 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 배지를 조심스럽게 흡인하고, 100μL 배지당 2,000만 개의 무장 T 세포 농도로 재현탁합니다.
- 생쥐에 주입 및 생착
- 1L/min 산소에 3.5%(v/v) 흡입 이소플루란을 공급하는 챔버에서 마우스를 마취합니다. 마우스는 뒷다리 페달 철수 반사가 사라졌을 때 완전히 마취됩니다.
알림: 절차 전반에 걸쳐 열 지원을 제공하십시오. - 26G 바늘을 사용하여 마우스당 100μL의 배지에 2천만 개의 T 세포를 안와후로 주입합니다.
- 생체 내에서 T 세포 생존을 지원하기 위해 1,000U 재조합 IL-2를 피하 투여합니다.
- 이중특이적 항체를 안와후(T 세포 주입에 사용되지 않는 눈 내로) 또는 복강내로 투여한다. 생쥐가 마취에서 회복하고 새장으로 돌아갈 수 있도록하십시오.
참고: 여기서도 실험실에서 생성된 독점 항체가 사용되었지만 상업적으로 이용 가능한 항체를 대신 사용할 수 있습니다. 여기의 실험에서, 투여량당 마우스당 0.3-10 μg의 항체를 투여하였다. 항체는 3-4주 동안 일주일에 두 번 투여되었습니다.
- 1L/min 산소에 3.5%(v/v) 흡입 이소플루란을 공급하는 챔버에서 마우스를 마취합니다. 마우스는 뒷다리 페달 철수 반사가 사라졌을 때 완전히 마취됩니다.
4. 루시페라아제 형질도입 T 세포가 생착된 마우스의 생체 내 이미징
참고: 이 단계는 이미징 당일에 수행되어야 하며, T 세포 및/또는 항체가 마우스에 투여되는 날과 반드시 같은 날은 아닙니다. 전형적으로, 우리는 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 투여 후 24시간 후에 이미징을 수행합니다.
- D-루시페린의 제조
- D-루시페린 1g을 멸균 PBS 33.3mL(최종 농도: 30mg/mL)에 녹입니다.
- 용해된 D-루시페린을 33 x 1.5 mL 미세원심분리기 튜브에 분취하여 튜브를 -20°C로 유지합니다.
- 이미징 당일, 이미징할 동물의 수에 대해 30mg/mL D-루시페린의 충분한 분취량을 해동합니다. 하나의 튜브로 10 마리의 동물에게 충분합니다.
알림: 사용 후 남은 D-루시페린을 다시 얼리십시오. D-루시페린은 최소 5번의 동결/해동 주기 동안 안정적입니다.
- 생쥐에 D-루시페린 투여
참고: D-루시페린을 마우스에 투여하기 전에 이미징 소프트웨어를 열고 시스템을 초기화하십시오. 카메라는 냉각하는 데 몇 분이 걸릴 수 있으며, 이는 마우스에 D-luciferin을 주입하기 전에 수행되어야 기판 투여 후 5분 후에 이미징이 이루어질 수 있습니다.- 1L/min 산소에 3.5%(v/v) 흡입 이소플루란을 공급하는 챔버에서 최대 5마리의 마우스를 마취합니다. 마우스는 뒷다리 페달 철수 반사가 사라졌을 때 완전히 마취됩니다.
- 마우스가 완전히 마취되면 26G 바늘로 안와 후 주사로 마우스당 30mg/mL D-루시페린 100μL(마우스당 3mg)를 투여합니다. D-luciferin을 다음 그룹에 투여하기 전에 이 마우스 그룹을 이미지화합니다. 다음 그룹의 마우스를 이소플루란 챔버에 넣어 이전 그룹이 이미징되는 동안 마취합니다.
- 루시페라아제 형질도입된 T 세포 이미징
- 마취된 마우스를 이미저의 기밀 챔버로 옮기고 0.5L/min에서 3% 이소플루란을 계속 투여합니다. 이종 이식편을 지탱하는 측면이 카메라를 향하도록 마우스를 옆으로 눕힙니다. 마우스를 앙와위 자세로 사용하여 폐의 T 세포 존재를 평가하기 위해 또 다른 이미지 세트를 촬영합니다.
- 획득 제어판을 사용하여 발광(Luminescent), 사진(Photograph) 및 오버레이(Overlay)를 선택합니다. 노출 시간을 자동으로, 비닝을 중간으로, F/정지를 1로 설정합니다. 이미지를 획득합니다. 첫 번째 이미지 이후에는 첫 번째 이미지에 대해 자동으로 계산된 노출 시간과 일치하도록 노출 시간을 설정하여 후속 이미지를 직접 비교할 수 있습니다. 픽셀 채도 없이 가장 밝은 신호를 얻기 위한 최적의 노출 시간을 결정하기 위해 여러 노출 시간으로 이미지를 캡처하는 것이 유용할 수 있습니다.
- 이소플루란에서 생쥐를 제거하고 새장으로 돌아가 깨어 있고 걸을 수 있을 때까지 관찰합니다.
- 모든 그룹이 이미지화될 때까지 4.2.1단계부터 단계를 반복합니다.
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Representative Results
단계 4.3에 기술된 바와 같이, 마우스는 상이한 조직에서의 T 세포의 존재를 평가하기 위해 영상화 동안 상이한 위치에 배향될 수 있다. 앙와위 자세는 폐의 T 세포를 평가할 수 있게 하며, 이는 주사 후 초기 시점에서 일반적입니다. 피하 이종이편이 위를 향하도록 하는 측면 위치는 종양으로의 T 세포 이동을 가장 잘 평가하는 데 사용됩니다. 암컷 C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac 마우스를 본 원고에 기재된 모든 실험에 사용하였다. 그림 1은 GD2 양성 이종이식 보유 마우스에 GD2 BsAb 또는 루시페라아제 형질도입 T 세포와 별도로 주사된 GD2 BsAb로 무장한 루시페라아제 형질도입 T 세포 중 하나를 처리한 실험의 이미지를 보여줍니다17. 그림 1A는 무장한 T 세포가 비무장 T 세포보다 더 빨리 종양으로 이동하여(그림 1B) 폐를 2일 더 빨리 떠난다는 것을 보여줍니다. 도 1C는 이러한 현상의 정량화를 나타낸 것이다. 도 1E-G는 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 주입 후 적어도 28일 동안 T 세포 트래피킹을 모니터링할 수 있다는 것을 보여주며, 연구자들이 T 세포 침윤의 스냅샷만을 허용하는 면역조직화학(IHC)과 같은 다른 기술과 달리, 치료 과정 전반에 걸쳐 T 세포 귀환 및 지속성을 추적할 수 있게 한다.
생체 내에서 T 세포 트래피킹을 평가할 수 있는 능력이 없으면 T-BsAb를 테스트하는 연구자는 T 세포가 치료 중에 종양에 침투하여 지속되는지 여부를 결정할 수 없습니다. 동물을 희생시키고 IHC를 수행하지 않고 치료가 실패하는 경우, 실패가 T 세포 이동의 결여, 지속성, T 세포 고갈, 또는 임의의 다른 원인에 기인하는지 여부를 아는 것이 어렵거나 불가능할 수 있다. 도 2A-C는 유방암 환자 유래 이종이식 보유 마우스를 루시페라아제-형질도입된 인간 T 세포 및 Fc 기능을 침묵시키기 위해 상이한 돌연변이를 갖는 HER2-표적 BsAb로 처리한 실험을 나타낸다7. 도 2C는 침묵되지 않은 Fc를 사용한 HER2 BsAb를 사용한 처리가 대조군 BsAb에 비해 종양 성장에 영향을 미치지 않은 반면, N297A 돌연변이를 단독으로 또는 K322A 돌연변이와 조합하여 HER2 BsAb를 사용한 치료는 종양 성장을 완전히 중단시킬 수 있었다는 것을 보여준다. 도 2A 및 도 1B는 침묵 돌연변이가 있는 그룹에서, T 세포의 발광 신호가 주사 후 3일째에 더 높은 피크에 도달하고, 대조군 BsAb 및 비침묵된 HER2 BsAb에 비해 더 높은 수준에서 지속됨을 보여준다. 후속 실험은 T 세포 및 침묵되지 않은 Fcs를 가진 BsAbs로 처리된 마우스에서, 폐의 혈관주위 영역에 있는 T 세포가 쥐 호중구 및 대식세포에 의해 둘러싸여 있다는 것을 보여주었고, 이는 종양으로의 이동을 방지하는 BsAb-결합 T 세포의 Fc 의존성 격리를 시사한다. 종양에 상주하는 M2 편광 대식세포의 종양 유발 효과는 잘 설명되어 있습니다. 그림 3A,B는 신경모세포종 환자 유래 이종이식(PDX)이 있는 마우스에서 Ly6c 양성 대식세포의 고갈이 종양에 대한 T 세포 귀환을 유의하게 증가시켜 종양 성장을 감소시키고 생존을 연장한다는 것을 보여줍니다(그림 3C)18. 이 효과는 골육종 PDX에서 더욱 두드러집니다(그림 3D).
생체 내 T 세포 추적을 통해 연구자들은 T 세포 트래피킹 동역학이 구조적 구성을 포함한 항체 공학의 다른 변수에 의해 어떻게 영향을 받는지 모니터링할 수 있습니다. 이 기사의 서론에서 설명한 바와 같이, 우리 연구실의 이전 연구는 BsAb의 생체 내 효능에 대한 종양 및 T 세포 결합 팔의 이원가 및 시스 방향의 중요성을 강조했습니다. 도 4는 종양 항원 STEAP1을 표적으로 하는 BsAb 패널 중에서(도 4A), IgG-[L]-scFv 포맷이 T 세포의 첫 번째 투여 후 6일째에 유의하게 더 많은 T 세포 침윤을 초래했으며, 이는 치료 기간 동안 지속되었다는 것을 보여준다(도 4C)10. 이러한 현상은 시험관내 세포독성 분석법으로는 예측되지 않았으며(도 4B), in vivo 모델에서 in vitro 결과를 확인하는 것이 중요하다는 점을 강조하였다.
그림 1: 무장한 T 세포는 BsAb 지시 비무장 T 세포보다 더 빠른 종양 귀환 동역학을 나타내며 폐 격리를 빠르게 우회합니다. 루시페라아제-형질도입된 T 세포를 확장하고, BsAb (Luc(+) GD2-EATs)로 무장시켰다. GD2-BsAb(10μg)를 포함하거나 포함하지 않는 Luc(+) GD2-EAT(GD2-BsAb/2×10 7 T 세포 10μg) 또는 Luc(+) 비무장 T 세포(2 x 107 세포)를 평균 종양 부피가 100mm3에 도달했을 때 GD2 양성 신경모세포종 PDX 보유 마우스에 정맥 주사했습니다. (A) 종양으로 밀매되는 GD2-EAT의 생물발광 이미지. (B) 수일에 걸쳐 종양으로 이동하는 GD2 BsAb 지시 비무장 T 세포의 생물발광 이미지. (C) 종양 윤곽(ROI)에 통합된 픽셀당 총 플럭스 또는 복사(광자/s)로 표현되는 생물발광(n = 5마리의 마우스/그룹)으로 측정된 시간 경과에 따른 종양으로의 T 세포 침윤의 정량화. (D) GD2-EAT, GD2-BsAb 플러스 비무장 T 세포 또는 비무장 T 세포로 처리된 개별 마우스의 종양 성장 곡선. 표적 항원 특이적 EAT의 생체 내 지속성을 테스트하기 위해 Luc(+) GD2-EAT(10μg의 GD2-BsAb/2×10 7 T 세포로 무장) 또는 Luc(+) HER2-EAT(10μg의 HER2-BsAb/2×107 T 세포)를 골육종 TEOS1C PDX 보유 마우스에 정맥 투여했습니다. 7일과 14일에 비루시페라아제 형질도입 GD2-EAT 또는 HER2-EAT의 2회 추가 용량을 투여했습니다. (E) 치료 후 종양에서 Luc(+) EAT의 생물발광 정량화. (F) GD2-EAT, HER2-EAT 또는 비무장 T 세포로 처리되거나 처리되지 않은 개별 마우스의 종양 성장 곡선. (G) 시간 경과에 따른 종양에서 Luc(+) GD2-EAT(위) 또는 Luc(+) HER2-EAT(아래)의 생물발광 이미지. Luc(+) EAT의 생물발광은 주사 후 28일 동안 검출되었습니다. 약어: EAT = 생체외 무장 T 세포; ROI = 관심 영역. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 수치는 Park et al.17에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: DKO 마우스에서 HER2 양성 인간 유방암 PDX로의 T 세포 트래피킹. (A) T 세포 밀매의 대표적인 생물발광 이미지. (B) 전체 종양 윤곽(ROI)에 걸쳐 통합된 각 픽셀에서 총 플럭스 또는 복사(광자/s)로 표현되는 생물발광(n = 5 마우스/그룹)에 의해 시간 경과에 따른 종양으로의 T 세포 이동의 정량화. (C) Ctrl BsAb, HER2 BsAb 및 이의 Fc 돌연변이체로 처리한 후 HER2 양성 유방암 PDX(M37) 성장(n=5 마우스/그룹). 제시된 결과는 적어도 3개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 결과이다. 유의미한 차이는 곡선 아래 면적(AUC)을 기준으로 계산되었습니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 수치는 Wang et al.7에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 단핵구 고갈이 BsAb 유도 T 세포 밀매 및 생체 내 항종양 반응에 미치는 영향. (A) 루시페라아제 형질도입 T 세포(Luc(+) T 세포) 또는 루시페라제 형질도입 GD2-BsAb 무장 T 세포(Luc(+) GD2-EAT)를 신경모세포종 환자 유래 이종이편(PDX)이 있는 마우스에 항-Ly6C 항체를 투여했습니다. (B) 종양의 병변에서의 생체발광을 모니터링하였다. 7일째의 생체발광 이미지 및 종양의 병변에서의 생체발광의 정량화. (C) 항-Ly6C 항체를 사용한 GD2-EAT에 의한 생체내 항종양 반응을 신경모세포종 PDX에 대해 테스트했습니다. (D) 항-Ly6C 항체를 사용한 GD2-EAT의 생체 내 항종양 효과를 골육종 PDX에 대해 테스트하고 장기 생존을 분석했습니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 생체내 항종양 효과는 AUC 및 생존 곡선 분석에 의해 비교되었다. 종양-침윤 림프구는 생물발광의 AUC를 사용하여 정량화하였다. 그림에 표시된 샘플 간의 차이는 두 세트의 데이터에 대한 양측 스튜던트 t-검정과 세 개 이상의 데이터 세트에 대한 Tukey의 사후 테스트를 사용한 일원 분산 분석을 사용하여 통계적 유의성을 테스트했습니다. * p < 0.05; ** p < 0.01; p < 0.001; p < 0.0001. 이 수치는 Park et al.18에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 항-STEAP1 T 세포 참여 이중특이성 항체의 항종양 활성. (A) STEAP1 BsAb의 6가지 구조적 형식의 개략도. (B) 상이한 형식의 STEAP1 BsAb를 사용하는 EFT 세포주(TC32 ad TC71)에 대한 항체 의존성 T 세포 매개 세포독성(ADTC) 분석. 이펙터 대 표적 (ET) 세포 비율은 10:1이었다. (C) (a) 6일 및 (b) 18일 치료 후 6가지 다른 형식의 STEAP1 BsAb로 무장한 Luc(+) T 세포의 생물발광 이미징(BLI) 및 종양 병변의 생물발광 강도 정량화. 루시페라아제 형질도입된 T 세포(Luc(+) T 세포)는 다양한 형식의 STEAP1 BsAb(10μg의 STEAP1 BsAb/2 x 107 T 세포)로 무장하고 보충 IL-2(1,000IU/용량)를 EFT PDX(ES15a)가 있는 마우스에 투여하고 BLI를 추적했습니다. 약어: EFT = 종양의 유잉 육종 계열; PDXs = 환자 유래 종양 이종이식; STEAP = 전립선의 6-막횡단 상피 항원. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 종양-침윤 림프구는 생체발광의 곡선 아래 면적을 계산하여 정량화하였다. 그림에 표시된 샘플 간의 차이는 Tukey의 사후 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 통계적 유의성에 대해 테스트되었습니다. p < 0.0001. 이 수치는 Lin et al.10에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
T-BsAb 블리나투모맙이 CD19 양성 혈액 악성 종양에 대해 승인되었지만 고형 종양에서 T-BsAb를 성공적으로 구현하는 것은 훨씬 더 어려운 것으로 입증되었습니다. 상피세포 부착 분자(EPCAM)에 대한 T-BsAb인 카투막소맙(Catumaxomab)은 난소암 환자의 악성 복수 치료제로 승인되었으나, 이후 상업적 이유로 약물 생산이 중단되었다19. 다른 T-BsAb는 고형 종양에 대해 승인되지 않았으며, 이는 이러한 유형의 치료와 관련된 문제를 강조합니다. 사이토카인 방출 증후군(CRS)으로 인한 독성은 일반적인 문제이지만 스테로이드와 사이토카인 억제제로 관리할 수 있습니다. 독성 외에도 고형 종양에 대한 T-BsAb 시험에서 효능 부족이 일반적입니다. 종양에서 T 세포 밀매 및 지속성을 유도하는 것은 TME14의 다양한 면역억제 인자로 인해 어려운 것으로 입증되었습니다. 그러나 전임상적으로도 시험관 내에서 우수한 성능을 발휘하는 T-BsAb가 생체 내에서 종양을 효과적으로 치료하지 못하는 이유는 종종 불분명합니다.
이 기사에 설명된 생체 내에서 실시간으로 T 세포를 추적하는 방법은 몇 가지 이유로 연구자에게 유용합니다. T 세포 귀환 모니터링은 연구자들이 T 세포 밀매가 시작된 시기와 치료 중 T 세포가 종양에서 얼마나 오래 지속되었는지를 결정할 수 있도록 함으로써 특정 T-BsAb의 성공 또는 실패 이유에 대한 기계론적 통찰력을 제공합니다. 이 방법은 여러 시점에서 반복될 수 있으므로 연구자들은 몇 주 동안 T 세포 귀환의 동역학을 플롯할 수 있습니다. ( 도 1 의 대표적인 결과는 T 세포가 적어도 28일 동안 종양에서 지속된다는 것을 보여준다.) 또한 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 생체 내 이미징은 T 세포 침윤의 조직학적 평가를 위해 치료 중 동물을 희생할 필요가 없어 전체 비용과 실험당 필요한 동물 수를 줄입니다. 이미징은 필요한 만큼 자주 반복될 수 있기 때문에, 또한 여러 동물이 상이한 시점에서 희생되지 않는 한 본질적으로 단일 시점의 스냅샷인 조직학적 분석에 비해 T 세포 귀환 동역학의 훨씬 쉽고 철저한 평가를 가능하게 합니다.
이 방법의 가장 중요한 단계는 루시페라아제 구조체를 사용한 T 세포의 성공적인 형질도입입니다. 형질도입에 실패하면 T 세포 사멸 또는 생체 내에서 루시페라아제 신호의 결핍이 발생할 수 있습니다. T 세포가 형질도입 후 예상대로 확장되지 않는 경우, 형질도입 과정으로부터 잠재적인 독성을 감소시키기 위해 형질도입되는 바이러스 역가를 감소시키는 것이 가능할 수 있다. 또 다른 접근법은 T 세포를 더 큰 세포 배양 용기로 확장하기 전에 T 세포가 더 융합될 수 있도록 T 세포 확장 단계 사이에 하루를 더 기다리는 것입니다. T 세포를 마우스에 주입하기 전에 유세포 분석(TD 토마토 리포터의 발현을 확인하기 위해) 또는 생체 발광 플레이트 리더를 사용하여 형질도입 성공을 확인하는 것이 좋습니다. 형질도입된 T 세포가 생체발광 이미징으로 여전히 가시화되지 않는 경우, T 세포의 수가 이 기술을 사용하여 검출하기에 너무 적을 수 있습니다. Rabinovich et al.은 강화된 반딧불이 루시페라아제를 사용하여 10개의 쥐 T 세포를 검출하는 유사한 방법을 설명하며, 이는 이러한 수준의 민감도를 필요로 하는 상황에서 구현될 수 있다20.
요약하면, 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 생체 내 추적은 암의 면역 저하 마우스 모델에서 T-BsAb를 연구하는 연구자들에게 유용한 도구를 제공합니다. 위에서 논의된 응용 분야에 더하여, 이 T 세포 추적 방법은 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포에 적용되었으며, 표면적으로는 입양적으로 전달된 T 세포를 활용하는 syngeneic 마우스 모델에도 적용될 수 있을 것이다21. 우리는 이 전략이 중개 T-BsAb를 개발하는 연구자들에게 도움이 되고 고형 종양 환자에서 이러한 치료법의 성공을 높일 수 있기를 바랍니다.
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Disclosures
NKC는 Y-mAbs Therapeutics로부터 상업 연구 보조금을 받았다고 보고했습니다. NKC는 MSK가 Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand 및 Abpro-labs에 라이선스를 부여한 특허의 발명가이자 소유자입니다. MSK와 NKC는 Y-mAb에 재정적 이해관계가 있습니다. NKC는 Eureka Therapeutics로부터 스톡 옵션을 받았다고 보고합니다. HFG 및 MEC에는 관련 공개가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 이 기사의 대표 결과 섹션에 설명된 실험에 사용된 루시페라아제 구조를 공유해 주신 Vladimir Ponomarev 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030-10G | |
| CD3/CD28 beads | Gibco (ThermoFisher) | 11161D | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | |
| DNA in vitro transfection reagent (polyjet) | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| FBS | Gibco (ThermoFisher) | 10437028 | |
| Gag/pol plasmid | Addgene | 14887 | |
| GFP plasmid | Addgene | 11150-DNA.cg | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco (ThermoFisher) | 15140122 | |
| Recombinant human IL-2 | R&D Systems | 202-IL-010/CF | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Trypsin | Gibco (ThermoFisher) | 25-300-120 | |
| VSV-G plasmid | Addgene | 8454 |
References
- Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).
- Dreier, T., et al. T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct. The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).
- Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells. Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).
- Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy. Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).
- Santich, B. H., et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies. Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).
- Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency. Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).
- Park, J. A., Cheung, N. V. GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172 (2020).
- Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).
- Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).
- Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).
- Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia. Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).
- Hoseini, S. S., et al. T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).
- Li, H., Er Saw, P., Song, E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).
- Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
- Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).
- Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
- Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142 (2021).
- Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis. Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).
- Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).
- Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).
