מעקב אחר סחר בתאי T הנגרמים על ידי נוגדנים דו-ספציפיים באמצעות תאי T אנושיים מותמרים של לוציפראז
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה להמרת תאי T אנושיים עם לוציפראז כדי להקל על מעקב in vivo אחר סחר בתאי T המושרה על ידי נוגדנים דו-ספציפיים לגידולים במחקרים כדי להעריך את היעילות והמנגנון נגד גידולים של נוגדנים דו-ספציפיים העוסקים בתאי T.
Abstract
נוגדנים דו-ספציפיים העוסקים בתאי T (T-BsAbs) נמצאים בשלבים שונים של פיתוח פרה-קליני ובדיקות קליניות לגידולים מוצקים. גורמים כגון ערכיות, סידור מרחבי, מרחק בין-תחומי ומוטציות Fc משפיעים על היעילות האנטי-סרטנית של טיפולים אלה, בדרך כלל על ידי השפעה על הביות של תאי T לגידולים, מה שנותר אתגר גדול. כאן, אנו מתארים שיטה להתמרה של תאי T אנושיים פעילים עם לוציפראז, המאפשרת מעקב in vivo של תאי T במהלך מחקרי טיפול T-BsAb. היכולת של T-BsAbs להפנות תאי T לגידולים ניתנת להערכה כמותית במספר נקודות זמן במהלך הטיפול, מה שמאפשר לחוקרים לקשר את היעילות האנטי-סרטנית של T-BsAbs והתערבויות אחרות עם ההתמדה של תאי T בגידולים. שיטה זו מקלה על הצורך להקריב בעלי חיים במהלך הטיפול כדי להעריך היסטולוגית את חדירת תאי T וניתן לחזור עליה במספר נקודות זמן כדי לקבוע את הקינטיקה של סחר בתאי T במהלך הטיפול ולאחריו.
Introduction
נוגדנים דו-ספציפיים העוסקים בתאי T (T-BsAbs) הם נוגדנים מהונדסים המשמשים למתן ספציפיות מלאכותית לתאי T רב-שבטיים על ידי הפעלת תאי T דרך זרוע קשירה אחת ואנטיגן גידולי דרך זרוע קושרת אחרת. טכנולוגיה זו יושמה בהצלחה על סרטן המטולוגי (CD19-targeting blinatumomab1), ומספר רב של T-BsAbs נמצאים בפיתוח פרה-קליני וקליני עבור מגוון גידולים מוצקים כמו גם2. T-BsAbs מפעילים תאי T רב-שבטיים באופן בלתי תלוי בקומפלקס היסטו-תאימות (MHC), ולכן אפילו גידולים שמפחיתים את הרגולציה של אנטיגנים לויקוציטים אנושיים (HLAs) רגישים לסוג זה של טיפול 3,4. T-BsAbs פותחו בעשרות פורמטים שונים, עם הבדלים בערכיות ובסידור המרחבי של תא T וזרועות קשירת גידולים, מרחקים בין תחומים, והכללת תחום Fc, המשפיע על מחצית החיים ויכול לגרום לפונקציות אפקט אם קיים5. עבודות קודמות במעבדה שלנו הראו כי גורמים אלה משפיעים באופן משמעותי על היעילות נגד גידולים של T-BsAbs, עם הבדלים של עד פי 1,000 בעוצמה6. באמצעות עבודה זו, זיהינו את פורמט IgG-[L]-scFv כפלטפורמה האידיאלית עבור T-BsAbs (ראה סעיף תוצאות מייצגות לפרטים נוספים לגבי פורמטים של T-BsAb), ויישמנו פלטפורמה זו על מטרות כולל GD2 (נוירובלסטומה), HER2 (סרטן השד ואוסטאוסרקומה), GPA33 (סרטן המעי הגס), STEAP1 (יואינג סרקומה), CD19 (ממאירויות תאי B) ו- CD33 (ממאירויות תאי B)7, 8,9,10,11,12,13.
אחד האתגרים העיקריים ביישום מוצלח של טיפול T-BsAb בגידולים מוצקים הוא התגברות על מיקרו-סביבה של גידולים מדכאי חיסון (TME) כדי להניע סחר בתאי T לגידולים14. הגורמים המשפיעים על יעילות T-BsAb שתוארו לעיל משפיעים באופן משמעותי על היכולת של T-BsAbs לגרום ביעילות לביות תאי T לגידולים, אך קשה להעריך השפעה זו במערכת in vivo בזמן אמת. כתב יד זה מספק תיאור מפורט של השימוש בתאי T מותמרים לוציפראז במחקרים פרה-קליניים של T-BsAbs כדי להעריך סחר בתאי T לרקמות שונות במודלים ניסיוניים של עכברים מדוכאי חיסון במהלך הטיפול. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק אמצעי להערכת חדירת תאי T לגידולים ולרקמות אחרות, כמו גם תובנה בזמן אמת לגבי קינטיקה והתמדה של ביות תאי T, ללא צורך להקריב בעלי חיים במהלך הטיפול. עבור המספר ההולך וגדל של חוקרים המתמקדים באימונותרפיה תאית, היכולת לעקוב אחר תאי T in vivo במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים היא קריטית. אנו שואפים לספק תיאור יסודי ומפורט של השיטה בה השתמשנו למעקב אחר תאי T מותמרים של לוציפראז כדי לאפשר לחוקרים אחרים לשכפל בקלות טכניקה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד T-BsAb blinatumomab אושר עבור ממאירויות המטולוגיות חיוביות CD19, היישום המוצלח של T-BsAbs בגידולים מוצקים הוכח הרבה יותר קשה. Catumaxomab, T-BsAb המכוון נגד מולקולת הידבקות תאי אפיתל (EPCAM), אושר לטיפול במיימת ממאירה בחולות סרטן השחלות, אך ייצור התרופה הופסק לאחר מכן מסיבות מסחריות19. T-BsAbs אחרים ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לד”ר ולדימיר פונומרב על שיתוף מבני הלוציפראז המשמשים בניסויים המתוארים בסעיף התוצאות המייצגות במאמר זה.
Materials
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030-10G | |
| CD3/CD28 beads | Gibco (ThermoFisher) | 11161D | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | |
| DNA in vitro transfection reagent (polyjet) | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| FBS | Gibco (ThermoFisher) | 10437028 | |
| Gag/pol plasmid | Addgene | 14887 | |
| GFP plasmid | Addgene | 11150-DNA.cg | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco (ThermoFisher) | 15140122 | |
| Recombinant human IL-2 | R&D Systems | 202-IL-010/CF | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Trypsin | Gibco (ThermoFisher) | 25-300-120 | |
| VSV-G plasmid | Addgene | 8454 |
References
- Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).
- Dreier, T., et al. T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct. The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).
- Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells. Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).
- Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy. Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).
- Santich, B. H., et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies. Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).
- Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency. Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).
- Park, J. A., Cheung, N. V. GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172 (2020).
- Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).
- Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).
- Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).
- Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia. Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).
- Hoseini, S. S., et al. T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).
- Li, H., Er Saw, P., Song, E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).
- Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
- Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).
- Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
- Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142 (2021).
- Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis. Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).
- Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).
- Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).
