Monitoraggio del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici utilizzando cellule T umane trasdotte dalla luciferasi
Summary
Qui, descriviamo un metodo per trasdurre le cellule T umane con luciferasi per facilitare il monitoraggio in vivo del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici ai tumori in studi per valutare l’efficacia antitumorale e il meccanismo degli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T.
Abstract
Gli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T (T-BsAbs) sono in varie fasi di sviluppo preclinico e test clinici per i tumori solidi. Fattori come la valenza, la disposizione spaziale, la distanza interdominio e le mutazioni Fc influenzano l’efficacia antitumorale di queste terapie, comunemente influenzando l’homing delle cellule T nei tumori, che rimane una grande sfida. Qui, descriviamo un metodo per trasdurre le cellule T umane attivate con luciferasi, consentendo il tracciamento in vivo delle cellule T durante gli studi di terapia T-BsAb. La capacità di T-BsAbs di reindirizzare le cellule T ai tumori può essere valutata quantitativamente in più punti temporali durante il trattamento, consentendo ai ricercatori di correlare l’efficacia antitumorale di T-BsAbs e altri interventi con la persistenza delle cellule T nei tumori. Questo metodo allevia la necessità di sacrificare gli animali durante il trattamento per valutare istologicamente l’infiltrazione delle cellule T e può essere ripetuto in più punti temporali per determinare la cinetica del traffico di cellule T durante e dopo il trattamento.
Introduction
Gli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T (T-BsAbs) sono anticorpi ingegnerizzati utilizzati per fornire specificità artificiale alle cellule T policlonali coinvolgendo le cellule T attraverso un braccio legante e un antigene tumorale attraverso un altro braccio legante. Questa tecnologia è stata applicata con successo ai tumori ematologici (CD19-targeting blinatumomab1), e numerosi T-BsAb sono in fase di sviluppo preclinico e clinico per una varietà di tumori solidi così come2. I T-BsAb coinvolgono le cellule T policlonali in modo indipendente dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), e quindi anche i tumori che sottoregolano gli antigeni dei leucociti umani (HLA) sono suscettibili a questo tipo di terapia 3,4. I T-BsAb sono stati sviluppati in dozzine di formati diversi, con differenze nella valenza e nella disposizione spaziale delle cellule T e dei bracci leganti il tumore, le distanze interdomini e l’inclusione di un dominio Fc, che influenza l’emivita e può indurre funzioni effettrici se presente5. Precedenti lavori nel nostro laboratorio hanno dimostrato che questi fattori influenzano significativamente l’efficacia antitumorale di T-BsAbs, con differenze fino a 1.000 volte nella potenza6. Attraverso questo lavoro, abbiamo identificato il formato IgG-[L]-scFv come la piattaforma ideale per T-BsAbs (vedere la sezione Risultati rappresentativi per maggiori dettagli sui formati T-BsAb) e abbiamo applicato questa piattaforma a target tra cui GD2 (neuroblastoma), HER2 (cancro al seno e osteosarcoma), GPA33 (cancro del colon-retto), STEAP1 (sarcoma di Ewing), CD19 (tumori maligni delle cellule B) e CD33 (tumori maligni delle cellule B)7, 8,9,10,11,12,13.
Una delle principali sfide per implementare con successo la terapia T-BsAb nei tumori solidi è superare un microambiente tumorale immunosoppressivo (TME) per guidare il traffico di cellule T verso i tumori14. I fattori che influenzano l’efficacia di T-BsAb sopra descritti hanno un impatto significativo sulla capacità di T-BsAbs di indurre efficacemente l’homing delle cellule T ai tumori, ma questo effetto è difficile da valutare in un sistema in vivo in tempo reale. Questo manoscritto fornisce una descrizione dettagliata dell’uso delle cellule T trasdotte dalla luciferasi negli studi preclinici di T-BsAbs per valutare il traffico di cellule T verso vari tessuti in modelli murini immunocompromessi sperimentali durante il trattamento. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un mezzo per valutare l’infiltrazione delle cellule T nei tumori e in altri tessuti, nonché una visione in tempo reale della cinetica e della persistenza delle cellule T, senza la necessità di sacrificare animali durante il trattamento. Per il crescente numero di ricercatori che si concentrano sulle immunoterapie cellulari, la capacità di tracciare le cellule T in vivo in modelli animali preclinici è fondamentale. Miriamo a fornire una descrizione completa e dettagliata del metodo che abbiamo impiegato per tracciare le cellule T trasdotte dalla luciferasi per consentire ad altri ricercatori di replicare facilmente questa tecnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre il T-BsAb blinatumomab è stato approvato per le neoplasie ematologiche CD19-positive, l’implementazione di successo di T-BsAbs nei tumori solidi si è dimostrata molto più difficile. Catumaxomab, un T-BsAb diretto contro la molecola di adesione delle cellule epiteliali (EPCAM), è stato approvato per il trattamento dell’ascite maligna in pazienti con cancro ovarico, ma la produzione del farmaco è stata successivamente interrotta per motivi commerciali19. Nessun altro T-BsAbs è stato app…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Vladimir Ponomarev per aver condiviso i costrutti di luciferasi utilizzati negli esperimenti descritti nella sezione dei risultati rappresentativi di questo articolo.
Materials
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030-10G | |
| CD3/CD28 beads | Gibco (ThermoFisher) | 11161D | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | |
| DNA in vitro transfection reagent (polyjet) | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| FBS | Gibco (ThermoFisher) | 10437028 | |
| Gag/pol plasmid | Addgene | 14887 | |
| GFP plasmid | Addgene | 11150-DNA.cg | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco (ThermoFisher) | 15140122 | |
| Recombinant human IL-2 | R&D Systems | 202-IL-010/CF | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Trypsin | Gibco (ThermoFisher) | 25-300-120 | |
| VSV-G plasmid | Addgene | 8454 |
References
- Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).
- Dreier, T., et al. T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct. The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).
- Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells. Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).
- Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy. Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).
- Santich, B. H., et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies. Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).
- Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency. Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).
- Park, J. A., Cheung, N. V. GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172 (2020).
- Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).
- Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).
- Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).
- Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia. Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).
- Hoseini, S. S., et al. T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).
- Li, H., Er Saw, P., Song, E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).
- Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
- Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).
- Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
- Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142 (2021).
- Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis. Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).
- Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).
- Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).
