Estrazione, etichettatura e purificazione di cellule specifiche del lignaggio da follicoli antrali umani
Summary
Qui presentiamo protocolli per l’identificazione e la purificazione delle cellule ovariche dai follicoli antrali. Elaboriamo i metodi per l’elaborazione di ovaie intere per la crioconservazione di strisce corticali e allo stesso tempo raccogliamo follicoli antrali intatti che vengono trattati enzimaticamente per liberare più tipi di cellule residenti nel follicolo, tra cui granulosa, teca, endoteliale, ematopoietica e cellule stromali.
Abstract
L’attivazione, la crescita, lo sviluppo e la maturazione degli ovociti è un processo complesso che è coordinato non solo tra più tipi di cellule dell’ovaio, ma anche attraverso più punti di controllo all’interno del circuito ipotalamo / ipofisi / ovarico. All’interno dell’ovaio, più tipi di cellule specializzate crescono in stretta associazione con l’ovocita all’interno dei follicoli ovarici. La biologia di queste cellule è stata ben descritta nelle fasi successive, quando sono facilmente recuperate come sottoprodotti dei trattamenti di riproduzione assistita. Tuttavia, l’analisi approfondita di piccoli follicoli antrali isolati direttamente dall’ovaio non viene comunemente effettuata a causa della scarsità di tessuto ovarico umano e del limitato accesso all’ovaio nelle pazienti sottoposte a trattamenti di riproduzione assistita.
Questi metodi per il trattamento di ovaie intere per la crioconservazione di strisce corticali con la concomitante identificazione/isolamento delle cellule residenti nell’ovaio consentono l’analisi ad alta risoluzione delle prime fasi dello sviluppo del follicolo antrale. Dimostriamo protocolli per isolare tipi di cellule discrete trattando enzimaticamente i follicoli antrali e separando le cellule granulosa, teca, endoteliale, ematopoietica e stromale. L’isolamento delle cellule dai follicoli antrali a varie dimensioni e fasi di sviluppo consente l’analisi completa dei meccanismi cellulari e molecolari che guidano la crescita del follicolo e la fisiologia ovarica e fornisce una fonte di cellule vitali che possono essere coltivate in vitro per ricapitolare il microambiente follicolare.
Introduction
Gli elementi funzionali primari dell’ovaio umano sono i follicoli, che governano la crescita e lo sviluppo degli ovociti. I protocolli per l’isolamento delle cellule follicolari sono stati ben stabiliti nel contesto della fecondazione in vitro , ma questi sono appropriati solo per la raccolta di cellule da follicoli luteinizzati nel punto di prelievo ovocitario1. Abbiamo sviluppato un protocollo che consente l’isolamento di popolazioni cellulari discrete da follicoli antrali in diversi stadi di sviluppo che derivano da ovaie native o tessuto ovarico xenotrapiantato2. Sebbene vi sia consenso sul fatto che i contributi delle cellule residenti nel follicolo alla coltivazione dell’ovocita siano molto importanti, pochi studi hanno identificato ed estratto prospetticamente i sottotipi fenotipici unici presenti nei follicoli dello stadio antrale. Una comprensione più profonda della gerarchia di differenziazione e della trasduzione del segnale tra cellule specializzate durante le diverse fasi di sviluppo potrebbe ampliare la nostra comprensione della fisiologia ovarica in condizioni omeostatiche e patologiche. Inoltre, la discriminazione dei sottotipi cellulari discreti e i loro contributi molecolari alla crescita/maturazione del follicolo possono fornire un mezzo per generare surrogati ex vivo che ricostruiscono la funzione ovarica per favorire la maturazione degli ovociti e/o trattare la disfunzione endocrina.
Ogni tipo di cellula unica all’interno dell’ovaio contribuisce alla complessa funzione del follicolo, che funziona efficacemente come un mini-organo discreto per favorire la crescita e la maturazione dell’ovocita che contiene. L’ovocita, il fulcro del follicolo, è direttamente avvolto da uno strato continuo di cellule della granulosa (GC), con le cellule della teca (TC) che formano uno strato secondario di cellule che si combinano con l’ovocita e i GC per comporre l’unità follicolare. Sebbene classificati in due gruppi, GC e TC contengono numerosi sottotipi. I GC sono classificati in base alla loro posizione all’interno del follicolo; I GC che circondano l’ovocita rispetto a quelli adiacenti alla membrana basale sono designati rispettivamente come GC oophorous e murali e questi sottotipi mostrano firme trascrittomiche uniche. I TC hanno numerosi sottotipi che funzionano per fornire supporto steroidogenico, metabolico e strutturale. Le cellule endoteliali, perivascolari e immunitarie svolgono un ruolo centrale nel mantenimento della normale fisiologia ovarica. Lo stroma ovarico serve non solo come substrato per la crescita del follicolo, ma probabilmente fornisce anche una fonte di progenitori che danno origine ai TC. Questo complesso multistrato di sottotipi cellulari all’interno dell’ovaio è ciò che consente la sua funzione sia come organo endocrino che riproduttivo.
Questo articolo presenta un protocollo per l’identificazione e la purificazione di cellule granulosa, teca, stromale, endoteliali ed ematopoietiche dai follicoli antrali. Abbiamo utilizzato questo protocollo per isolare queste cellule ovariche e analizzarle utilizzando il sequenziamento a singola cellula, seguito da colorazioni specifiche nei follicoli di diversi stadi di sviluppo. Il protocollo fornisce una metodologia semplice che è replicabile e consentirà l’analisi ad alta risoluzione sia della fisiologia che della patologia dell’ovaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una migliore risoluzione della diversità cellulare all’interno dei follicoli ovarici è clinicamente importante per diversi motivi. Nell’applicare il protocollo di cui sopra all’isolamento dei sottotipi fenotipici unici che risiedono all’interno dei follicoli dello stadio antrale, devono essere considerati diversi fattori. In primo luogo, la salute e la vitalità del tessuto ovarico da cui deriva il follicolo antrale è fondamentale per determinare la qualità delle cellule e il successo delle applicazioni a valle. Ques…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il sostegno del Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) e dell’Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G è supportato dalla borsa di studio post-dottorato NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine.
Materials
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| – 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| – 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| – 3.42 g of sucrose | |||
| – 10.65 mL of DMSO | |||
| – 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
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