인간 Antral Follicles에서 계통 특이적 세포의 추출, 표지 및 정제
Summary
여기에서 우리는 전방 난포에서 난소 세포를 식별하고 정제하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 피질 스트립의 냉동 보존을 위해 전체 난소를 처리하는 동시에 과립구, 테카, 내피, 조혈 및 기질 세포를 포함한 여러 난포 상주 세포 유형을 유리하기 위해 효소로 처리되는 온전한 전방 난포를 수확하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.
Abstract
난모세포의 활성화, 성장, 발달 및 성숙은 난소의 여러 세포 유형뿐만 아니라 시상하부/뇌하수체/난소 회로 내의 여러 제어 지점에 걸쳐 조정되는 복잡한 과정입니다. 난소 내에서 여러 특수 세포 유형이 난소 난포 내의 난모세포와 밀접하게 연관되어 성장합니다. 이 세포의 생물학은 보조 생식 치료의 부산물로 쉽게 회수되는 후기 단계에서 잘 설명되었습니다. 그러나 난소에서 직접 분리된 작은 전방 난포에 대한 심층 분석은 인간 난소 조직의 부족과 보조 생식 치료를 받는 환자의 난소에 대한 제한된 접근으로 인해 일반적으로 수행되지 않습니다.
난소 상주 세포의 동시 식별/분리와 함께 피질 스트립의 냉동 보존을 위해 전체 난소를 처리하는 이러한 방법은 전방 난포 발달의 초기 단계에 대한 고해상도 분석을 가능하게 합니다. 우리는 전방 난포를 효소로 처리하고 과립구, 테카, 내피, 조혈 및 기질 세포를 분리하여 개별 세포 유형을 분리하는 프로토콜을 보여줍니다. 다양한 크기와 발달 단계에서 전방 난포에서 세포를 분리하면 난포 성장과 난소 생리학을 유도하는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 포괄적인 분석이 가능하며 난포 미세 환경을 요약하기 위해 시험관 내에서 배양할 수 있는 생존 가능한 세포의 공급원을 제공합니다.
Introduction
인간 난소의 주요 기능 요소는 난모세포의 성장과 발달을 관장하는 난포입니다. 난포 세포 분리를 위한 프로토콜은 체외 수정과 관련하여 잘 확립되어 있지만, 이는 난모세포 회수 시점의 황 체 화 난포에서 세포를 채취하는 데만 적합하다1. 우리는 천연 난소 또는 이종 이식된 난소 조직에서 발생하는 다양한 발달 단계의 전방 난포에서 분리된 세포 집단을 분리할 수 있는 프로토콜을 개발했습니다2. 난모세포 배양에 대한 난포 상주 세포의 기여가 매우 중요하다는 데 동의하지만, 전향적 난포에 존재하는 독특한 표현형 아형을 전향적으로 확인하고 추출한 연구는 거의 없습니다. 다양한 발달 단계에서 특수 세포 간의 분화 계층 구조와 신호 전달에 대한 더 깊은 이해는 항상성 및 병리학적 조건에서 난소 생리학에 대한 이해를 넓힐 수 있습니다. 또한, 분리된 세포 아형의 구별 및 난포 성장/성숙에 대한 분자적 기여는 난모세포 성숙을 촉진하고 및/또는 내분비 기능 장애를 치료하기 위해 난소 기능을 재구성하는 생체 외 대리모를 생성하는 수단을 제공할 수 있습니다.
난소 내의 각각의 고유한 세포 유형은 난포의 복잡한 기능에 기여하며, 난포는 난포에 포함된 난모세포의 성장과 성숙을 촉진하는 별개의 미니 기관으로 효과적으로 기능합니다. 난포의 중심인 난모세포는 과립구 세포(GC)의 연속적인 층으로 직접 둘러싸여 있으며, 테카 세포(TC)는 난모세포 및 GC와 결합하여 난포 단위를 구성하는 세포의 2차 층을 형성합니다. 두 그룹으로 분류되지만 GC와 TC에는 수많은 하위 유형이 포함되어 있습니다. GC는 난포 내의 위치에 따라 분류됩니다. 난모세포를 둘러싸고 있는 GC와 기저막에 인접한 GC는 각각 난모세포 및 벽화 GC로 지정되며 이러한 아형은 고유한 전사체 시그니처를 나타냅니다. TC에는 스테로이드 생성, 대사 및 구조적 지원을 제공하는 기능을 하는 수많은 하위 유형이 있습니다. 내피, 혈관주위 및 면역 세포는 정상적인 난소 생리를 유지하는 데 중심적인 역할을 합니다. 난소 기질은 난포 성장의 기질 역할을 할 뿐만 아니라 TC를 유발하는 전구체의 공급원을 제공할 가능성이 높습니다. 난소 내의 세포 아형의 다층 복합체는 내분비 및 생식 기관으로서의 기능을 가능하게합니다.
이 논문은 전방 난포에서 과립구, 테카, 간질, 내피 및 조혈 세포의 식별 및 정제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 이러한 난소 세포를 분리하고 단일 세포 시퀀싱을 사용하여 분석한 다음 다양한 발달 단계의 난포에서 특정 염색을 수행했습니다. 이 프로토콜은 복제 가능한 간단한 방법론을 제공하며 난소의 생리학 및 병리학 모두에 대한 고해상도 분석을 가능하게 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
난소 난포 내의 세포 다양성의 더 나은 분해능은 여러 가지 이유로 임상적으로 중요합니다. 위의 프로토콜을 전방 단계 난포 내에 존재하는 고유한 표현형 아형의 분리에 적용할 때 몇 가지 요소를 고려해야 합니다. 첫째, 전방 난포가 유래된 난소 조직의 건강과 생존력은 세포의 품질과 다운스트림 적용의 성공을 결정하는 데 중요합니다. 이것은 허혈 간격을 최소화하고, 신속하게 (바람직하게는…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (DJ)와 Hung-Ching Liu Research Scholar Award (LM)의 지원을 인정합니다. NLG는 NYSTEM 줄기 세포 및 재생 의학 박사후 과정 교육 보조금의 지원을 받습니다.
Materials
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| – 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| – 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| – 3.42 g of sucrose | |||
| – 10.65 mL of DMSO | |||
| – 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
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