कृंतक आंख का सूक्ष्म विच्छेदन
Summary
यह पेपर कृन्तकों में ओकुलर माइक्रो-विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रक्रिया में नेत्रगोलक के न्यूक्लियेशन के साथ-साथ निकोटिटेटिंग झिल्ली (यानी, तीसरी पलक) शामिल है। इसके बाद पीछे और पूर्ववर्ती आंखों के कप को अलग किया जाता है।
Abstract
कृंतक आंख के ओकुलर माइक्रो-विच्छेदन में पूर्ववर्ती और पीछे के आंख के कप प्राप्त करने के लिए संलग्न छिद्रित झिल्ली, या तीसरी पलक के साथ एन्यूक्लिएटेड नेत्रगोलक का विभाजन शामिल है। इस तकनीक के साथ, कॉर्नियल ऊतक, तंत्रिका ऊतक, रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) ऊतक और लेंस सहित आंख के उप-भागों को एक विशिष्ट ओकुलर ऊतक के पूरे भरण, क्रायो-सेक्शनिंग और / या एकल-कोशिका निलंबन के लिए प्राप्त किया जा सकता है। तीसरी पलक की उपस्थिति अद्वितीय और महत्वपूर्ण फायदे प्रस्तुत करती है, क्योंकि यह आंख के अभिविन्यास के रखरखाव को लाभ पहुंचाती है, जो किसी भी स्थानीय हस्तक्षेप के बाद आंखों के शरीर विज्ञान को समझने या आंख की स्थानिक स्थलाकृति से संबंधित ओकुलर विश्लेषण से जुड़े अध्ययनों में महत्वपूर्ण है।
इस विधि में, हमने ध्यान से और धीरे-धीरे एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशियों को काटकर और ऑप्टिक तंत्रिका को अलग करके तीसरी पलक के साथ सॉकेट पर नेत्रगोलक को अलग किया। एक माइक्रोब्लेड का उपयोग करके कॉर्नियल लिम्बस के माध्यम से नेत्रगोलक को छेद दिया गया था। चीरा का उपयोग प्रवेश बिंदु के रूप में किया गया था, जिससे चीरा बिंदु के माध्यम से माइक्रो-कैंची डालकर कॉर्नियल-स्क्लेरल जंक्शन के साथ काटने की अनुमति मिलती थी। परिधि के साथ छोटे और निरंतर कटौती की गई जब तक कि कप अलग नहीं हो गए। तंत्रिका रेटिना और आरपीई परतों को प्राप्त करने के लिए कोलिब्री ट्यूरिंग फोर्सप्स का उपयोग करके तंत्रिका रेटिना की पारभासी परत को धीरे से छीलकर इन्हें और विच्छेदित किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑप्टिक तंत्रिका तक पहुंचने तक ऑप्टिक केंद्र के लंबवत परिधि से तीन/चार समान दूरी के कट किए गए थे। इसने अर्धगोलाकार कपों को एक फूलों के आकार में खोल दिया ताकि वे सपाट गिर जाएं और आसानी से चढ़ सकें। इस तकनीक का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में कॉर्नियल होलमाउंट और रेटिना सेक्शन के लिए किया गया है। तीसरी पलक की उपस्थिति नाक-अस्थायी अभिविन्यास को चित्रित करती है, जो प्रत्यारोपण के बाद विभिन्न सेल थेरेपी हस्तक्षेपों के अध्ययन की अनुमति देती है और इस प्रकार, ऐसे अध्ययनों में विज़ुअलाइज़ेशन और सटीक प्रतिनिधित्व के लिए महत्वपूर्ण लक्षित शारीरिक सत्यापन।
Introduction
नेत्र विच्छेदन नेत्र अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण तकनीक है और जांचकर्ताओं को लक्षित अध्ययन के लिए आंख के खंडों तक पहुंचने की अनुमति दी है। इससे पहले, ओकुलर शोधकर्ताअपने अध्ययन के लिए रोगग्रस्त व्यक्तियों से ओकुलर ऊतक पर भरोसा करते थे। हालांकि, वर्षों से नेत्र कृंतक मॉडल1 के उपभेदों की उत्तरोत्तर बढ़ती संख्या ने मानव ओकुलर ऊतक की आवश्यकता को कम कर दिया है। इन माउस उपभेदों ने ओकुलर रोग और हस्तक्षेप की गहरी समझ की अनुमति दी है। फिर भी, उन्होंने ओकुलर माइक्रो-विच्छेदन की नवीन तकनीकों की आवश्यकता भी उत्पन्न की है। ऑपरेशन का छोटा आकार और सीमित क्षेत्र ओकुलर उप-भागों तक प्रभावी पहुंच को गंभीर रूप से बाधित करता है। इसके अलावा, पीछे और पूर्ववर्ती आंखों के कप की समरूप सेलुलर असेंबली के कारण, विच्छेदन के बाद लक्षित हस्तक्षेप करना मुश्किल है। लेजर2 और सर्जिकल माइक्रोडिसेक्शन 3,4 की वर्तमान सूक्ष्म विच्छेदन तकनीक ओकुलर अनुसंधान की ऐसी आवश्यकताओं को पूरा करने में अपर्याप्त हैं। लेजर माइक्रो-विच्छेदन एकल-कोशिका विश्लेषण में बहुत प्रभावी है, लेकिन लेजर प्रक्रिया2 से पहले विशिष्ट ऊतक को सूक्ष्म-विच्छेदित करने की आवश्यकता होती है। तकनीक आणविक विश्लेषण के लिए पूर्व-विच्छेदित ऊतक से रुचि के छोटे क्षेत्रों को अलग कर सकती है। इस प्रकार, तकनीक संपूर्ण तैयार करने या इष्टतम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अक्षीय रूप से पैक ओकुलर परतों के अलगाव के लिए उपयुक्त नहीं है।
सर्जिकल विधि सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है; इस विधि में ऑप्टिक तंत्रिका5 के माध्यम से आंख को स्थिर करना और फिर विच्छेदन करना शामिल है। यह अभ्यास कठिन है और किसी भी नाजुक ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है, क्योंकि गोलाकार आंख विच्छेदन के दौरान चलती रहती है। रेटिना परतों के विभिन्न वर्गों को अलग करने के लिए फायदेमंद होने के बावजूद, तकनीक विच्छेदन पर ऊतक के स्थानिक अभिविन्यास को सीमांकित नहीं कर सकती है।
विच्छेदन के दौरान, संलग्न निकोटिटिंग झिल्ली या तीसरी पलक (चित्रा 1) की उपस्थिति को बनाए रखना अद्वितीय और महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करता है। इस विधि में, सबसे पहले, नेत्रगोलक को तीसरी पलक के साथ एन्यूक्लिएटेड किया जाता है। फिर, तीसरी पलक का उपयोग आंख6 (चित्रा 2 ए) को गतिहीन करने के लिए किया जाता है। इसके बाद कॉर्नियल लिम्बस के माध्यम से नेत्रगोलक को छेदना और प्रवेश के बिंदु के रूप में चीरा का उपयोग करना (चित्रा 2 बी, सी)। फिर, आंखों के कप को परिधि के साथ पूर्वकाल और पीछे की ओर काटकर अलग किया जाता है (चित्रा 2 डी-जी)। पीछे के आईकप को आगे विच्छेदित करके, तंत्रिका रेटिना की पारभासी परत की पहचान की जा सकती है और धीरे से छील दिया जा सकता है। तीन या चार समान दूरी के कट तब प्राप्त अर्धगोलाकार पूर्ववर्ती और पीछे के कप में किए जाते हैं, जो इन फूलों के आकार के कपों को स्लाइड पर सपाट गिरने की अनुमति देते हैं (चित्रा 2 एच)।
तीसरी पलक विच्छेदन के दौरान आसान और कुशल हैंडलिंग में सहायता करती है, इस प्रकार विभिन्न ओकुलर परतों तक पहुंचने के दौरान और पूरे अंडे का उत्पादन करते समय ऊतक को न्यूनतम नुकसान सुनिश्चित करती है। इसके अलावा, तीसरी पलक की उपस्थिति विज़ुअलाइज़ेशन के दौरान स्थानीय हस्तक्षेप का पता लगाने और जांच करने में मदद करती है।
हमारी प्रयोगशाला में, प्रक्रिया, किसी भी लिंग के पी 28 पर सीबीए / जे या आरडी 1 माउस स्ट्रेन पर की गई है। प्रक्रिया जानवर के किसी भी तनाव, उम्र या लिंग पर की जा सकती है और इन विशेषताओं के अनुसार कोई पूर्वाग्रह नहीं है।
जानवरों को वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा गया था ( सामग्री की तालिका देखें) और राष्ट्रीय प्रतिरक्षा विज्ञान संस्थान (एनआईआई) में लघु पशु सुविधा (एसएएफ) में बनाए रखा गया था। उन्हें अलग-अलग हवादार पिंजरों (आईवीसी) में रखा गया था और एसिडयुक्त ऑटोक्लेव पानी और भोजन तक पहुंच प्राप्त हुई थी। उन्हें 21-23 डिग्री सेल्सियस पर और 14 घंटे / 10 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ बनाए रखा गया था।
नीचे दिए गए माउस आंख के सूक्ष्म विच्छेदन के लिए एक संशोधित शल्य चिकित्सा विधि है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कृंतक आंख के छोटे आकार और गोलाकार आकार के कारण ओकुलर माइक्रोडिसेक्शन एक मुश्किल काम पाया गया है, और कृंतक आंख को कुशल हैंडलिंग 8 के लिए नवीनतकनीकों की आवश्यकता होती है।
वर्तमान प्रद…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अलकनंदा मिश्रा, सेल बायोलॉजी एंड ह्यूमन एनाटॉमी विभाग, कैलिफोर्निया डेविस विश्वविद्यालय, यूएसए ने हमें नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ इम्यूनोलॉजी, नई दिल्ली में इस पद्धति में प्रशिक्षित किया। इस कार्य को जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार से राष्ट्रीय प्रतिरक्षा विज्ञान संस्थान, नई दिल्ली को प्राप्त कोर अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। पीएस को जैव प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा एक शोध फैलोशिप प्रदान की गई थी।
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
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