Microdissezione dell'occhio del roditore
Summary
Questo articolo presenta un protocollo per la micro-dissezione oculare nei roditori. Il processo comporta l’enucleazione del bulbo oculare insieme alla membrana nittitante (cioè la terza palpebra). Questo è poi seguito dalla separazione delle conchiglie oculari posteriori e anteriori.
Abstract
La microdissezione oculare dell’occhio del roditore comporta la segmentazione del bulbo oculare enucleato con la membrana nittitante attaccata, o terza palpebra, per ottenere le cosce oculari anteriori e posteriori. Con questa tecnica, le sottoparti dell’occhio, tra cui il tessuto corneale, il tessuto neurale, il tessuto epiteliale pigmentato retinico (RPE) e il cristallino, possono essere ottenute per interi, crio-sezionamento e / o sospensioni monocellulari di uno specifico tessuto oculare. La presenza della terza palpebra presenta vantaggi unici e significativi, in quanto favorisce il mantenimento dell’orientamento dell’occhio, importante per comprendere la fisiologia oculare a seguito di qualsiasi intervento localizzato o in studi che coinvolgono l’analisi oculare relativa alla topografia spaziale dell’occhio.
In questo metodo, abbiamo enucleato il bulbo oculare alla presa insieme alla terza palpebra tagliando attentamente e lentamente i muscoli extraoculari e recidendo il nervo ottico. Il bulbo oculare è stato perforato attraverso il limbus corneale usando una microlama. L’incisione è stata utilizzata come punto di ingresso, consentendo di tagliare lungo la giunzione corneale-sclerale inserendo micro-forbici attraverso il punto di incisione. Piccoli e continui tagli lungo la circonferenza sono stati fatti fino a quando le coppe si sono separate. Questi potrebbero essere ulteriormente sezionati sbucciando delicatamente lo strato traslucido della retina neurale usando una pinza di sutura Colibri per ottenere la retina neurale e gli strati RPE. Inoltre, tre/quattro tagli equidistanti sono stati effettuati dalla periferia perpendicolarmente al centro ottico fino a raggiungere il nervo ottico. Questo aprì le coppe emisferiche a forma di fiore in modo che cadessero piatte e potessero essere facilmente montate. Questa tecnica è stata utilizzata nel nostro laboratorio per interi corneali e sezioni retiniche. La presenza della terza palpebra delinea l’orientamento naso-temporale, che consente lo studio di vari interventi di terapia cellulare post-trapianto e, quindi, la validazione fisiologica mirata vitale per la visualizzazione e la rappresentazione accurata in tali studi.
Introduction
La dissezione oculare è una tecnica importante nella ricerca oftalmica e ha permesso ai ricercatori di accedere ai segmenti dell’occhio per studi mirati. In precedenza, i ricercatori oculari si affidavano al tessuto oculare di individui malati per i loro studi. Tuttavia, il numero progressivamente crescente di ceppi di roditori oftalmici modelli1 nel corso degli anni ha diminuito la necessità di tessuto oculare umano. Questi ceppi murini hanno permesso una comprensione più profonda delle malattie oculari e degli interventi. Tuttavia, hanno anche generato la necessità di tecniche innovative di micro-dissezione oculare. Le dimensioni ridotte e l’area operativa limitata limitano fortemente l’accesso efficace alle sottoparti oculari. Inoltre, a causa dell’assemblaggio cellulare omogeneo delle conchiglie oculari posteriori e anteriori, è difficile condurre interventi mirati post-dissezione. Le attuali tecniche di microdissezione del laser2 e della microdissezione chirurgica 3,4 sono inadeguate a soddisfare tali requisiti della ricerca oculare. La micro-dissezione laser è molto efficace nell’analisi di singole cellule, ma il tessuto specifico deve essere micro-sezionato prima della procedura laser2. La tecnica può isolare piccole regioni di interesse da un tessuto pre-sezionato per l’analisi molecolare. Pertanto, la tecnica non è adatta per la preparazione di interi supporti o per l’isolamento di strati oculari assialmente imballati per una visualizzazione ottimale.
Il metodo chirurgico è la tecnica più utilizzata; Questo metodo prevede l’immobilizzazione dell’occhio attraverso il nervo ottico5 e quindi l’esecuzione della dissezione. Questa pratica è ardua e può danneggiare qualsiasi tessuto fragile, poiché l’occhio sferico continua a muoversi durante la dissezione. Nonostante sia utile per isolare le varie sezioni degli strati retinici, la tecnica non può delimitare l’orientamento spaziale del tessuto al momento della dissezione.
Durante la dissezione, mantenere la presenza della membrana nittitante attaccata o della terza palpebra (Figura 1) presenta vantaggi unici e significativi. In questo metodo, in primo luogo, il bulbo oculare viene enucleato con la terza palpebra. Quindi, la terza palpebra viene utilizzata per immobilizzare l’occhio6 (Figura 2A). Questo è seguito perforando il bulbo oculare attraverso il limbus corneale e usando l’incisione come punto di ingresso (Figura 2B, C). Quindi, le conchiglie oculari vengono separate tagliando lungo la circonferenza anteriormente e posteriormente (Figura 2D-G). Sezionando ulteriormente la coppa oculare posteriore, lo strato traslucido della retina neurale può essere identificato e rimosso delicatamente. Vengono quindi effettuati tre o quattro tagli equidistanti nelle coppe emisferiche anteriori e posteriori ottenute, che consentono a queste coppe a forma di fiore di cadere piatte su un vetrino (Figura 2H).
La terza palpebra aiuta a maneggiare facilmente ed efficacemente durante la dissezione, garantendo così danni minimi al tessuto durante l’accesso ai vari strati oculari e durante la produzione di interi. Inoltre, la presenza della terza palpebra aiuta a individuare ed esaminare gli interventi localizzati durante la visualizzazione.
La procedura, nel nostro laboratorio, è stata eseguita su un ceppo di topo CBA/J o rd1 a P28 di qualsiasi sesso. La procedura può essere eseguita su qualsiasi ceppo, età o sesso dell’animale e non ha pregiudizi in base a queste caratteristiche.
Gli animali sono stati acquistati da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e mantenuti presso la Small Animal Facility (SAF) presso l’Istituto Nazionale di Immunologia (NII). Sono stati tenuti in gabbie ventilate individuali (IVC) e hanno ricevuto accesso ad libitum ad acqua e cibo acidificati in autoclave. Sono stati mantenuti a 21-23 °C e con un ciclo luce/buio di 14 h/10 h.
Di seguito è riportato un metodo chirurgico modificato per la micro-dissezione di un occhio di topo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microdissezione oculare si è rivelata un compito difficile a causa delle piccole dimensioni e della forma sferica dell’occhio del roditore e l’occhio del roditore richiede tecniche innovative per una manipolazione efficiente8.
Nell’attuale metodo dimostrato, il bulbo oculare del topo enucleato è ottenuto con la terza palpebra attaccata per una manipolazione efficace e facile. Utilizzando la terza palpebra, il bulbo oculare può essere immobilizzato completamente, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il Dr. Alaknanda Mishra, Dipartimento di Biologia Cellulare e Anatomia Umana, Università della California Davis, USA, ci ha addestrato in questo metodo presso l’Istituto Nazionale di Immunologia, Nuova Delhi. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione di base ricevuta dal Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell’India all’Istituto Nazionale di Immunologia, Nuova Delhi. P.S. ha ottenuto una borsa di ricerca dal Dipartimento di Biotecnologie.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (136), e57576 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Claybon, A., Bishop, A. J. Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).
- Steven, P., et al. Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
- Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour. Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).
- Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye. Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).
- Mishra, A., et al. Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).
