Метод изучения токсичности и агрегации α-синуклеина с использованием гуманизированной дрожжевой модели
Summary
Физиологическая модель in vivo α-синуклеина необходима для изучения и понимания патогенеза болезни Паркинсона. Описан метод мониторинга цитотоксичности и агрегатного образования α-синуклеина с использованием гуманизированной дрожжевой модели.
Abstract
Болезнь Паркинсона является вторым наиболее распространенным нейродегенеративным расстройством и характеризуется прогрессирующей гибелью клеток, вызванной образованием клеток Леви, содержащих неправильно свернутые и агрегированные α-синуклеин. α-синуклеин является обильным пресинаптическим белком, который регулирует торговлю синаптическими пузырьками, но накопление его белковых включений приводит к нейротоксичности. Недавние исследования показали, что различные генетические факторы, включая бактериальные шапероны, могут уменьшить образование α-синуклеиновых агрегатов in vitro. Тем не менее, также важно контролировать антиагрегационный эффект в клетке, чтобы применять его в качестве потенциального лечения для пациентов. Было бы идеально использовать нейронные клетки, но с этими клетками трудно обращаться и требуется много времени, чтобы продемонстрировать фенотип антиагрегации. Поэтому для дальнейшей оценки антиагрегационной активности in vivo требуется быстрый и эффективный инструмент in vivo . Описанный здесь метод использовался для мониторинга и анализа антиагрегационного фенотипа в гуманизированных дрожжах Saccharomyces cerevisiae, которые экспрессировали человеческий α-синуклеин. Этот протокол демонстрирует инструменты in vivo , которые могут быть использованы для мониторинга клеточной токсичности, вызванной α-синуклеином, а также образования агрегатов α-синуклеина в клетках.
Introduction
Болезнь Паркинсона (БП) является серьезной проблемой для стареющих обществ во всем мире. Агрегация α-синуклеина тесно связана с БП, а белковые агрегаты α-синуклеина широко используются в качестве молекулярного биомаркера для диагностики заболевания1. α-синуклеин представляет собой небольшой кислый белок (140 аминокислот в длину) с тремя доменами, а именно N-концевым липидсвязывающим α-спирали, амилоид-связывающим центральным доменом (NAC) и С-концевым кислотным хвостом2. Неправильное сворачивание α-синуклеина может происходить спонтанно и в конечном итоге приводит к образованию амилоидных агрегатов, называемых тельцами Леви3. α-синуклеин может способствовать патогенезу БП несколькими способами. В целом, считается, что его аномальные, растворимые олигомерные формы, называемые протофибриллами, являются токсичными видами, которые вызывают гибель нейрональных клеток, воздействуя на различные клеточные мишени, включая синаптическую функцию3.
Биологические модели, используемые для изучения нейродегенеративных заболеваний, должны иметь отношение к людям в отношении их генома и клеточной биологии. Лучшими моделями будут клеточные линии нейронов человека. Однако эти клеточные линии связаны с несколькими техническими проблемами, такими как трудности в поддержании культур, низкая эффективность трансфекции и высокие затраты4. По этим причинам требуется простой и надежный инструмент для ускорения прогресса в этой области исследований. Важно отметить, что инструмент должен быть простым в использовании для анализа собранных данных. С этой точки зрения широко используются различные модельные организмы, включая Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, дрожжи и грызунов5. Среди них дрожжи являются лучшим модельным организмом, потому что генетические манипуляции просты, и они дешевле, чем другие модельные организмы. Самое главное, дрожжи имеют большое сходство с человеческими клетками, такие как 60% гомология последовательности для человеческих ортологов и 25% близкая гомология с генами, связанными с человеческими заболеваниями6, и они также разделяют фундаментальную эукариотическую клеточную биологию. Дрожжи содержат много белков с аналогичными последовательностями и аналогичными функциями в клетках человека7. Действительно, дрожжи, экспрессирующие человеческие гены, широко использовались в качестве модельной системы для выяснения клеточных процессов8. Этот штамм дрожжей называется гуманизированными дрожжами и является полезным инструментом для изучения функции генов человека9. Гуманизированные дрожжи имеют преимущества для изучения генетических взаимодействий, потому что генетические манипуляции хорошо известны в дрожжах.
В этом исследовании мы использовали дрожжи Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма для изучения патогенеза БП, в частности, для изучения образования агрегатов α-синуклеина и цитотоксичности10. Для экспрессии α-синуклеина в почковых дрожжах штамм W303a использовался для трансформации с плазмидами, кодирующими дикий тип и семейные PD-ассоциированные варианты α-синуклеина. Поскольку штамм W303a имеет ауксотрофную мутацию на URA3, он применим для отбора клеток, содержащих плазмиды с URA3. Экспрессия α-синуклеина, закодированного в плазмиде, регулируется промотором GAL1 . Таким образом, уровень экспрессии α-синуклеина можно контролировать. Кроме того, слияние зеленого флуоресцентного белка (GFP) в С-концевой области α-синуклеина позволяет контролировать образование α-синуклеиновых очагов. Чтобы понять характеристики семейных PD-ассоциированных вариантов α-синуклеина, мы также экспрессировали эти варианты в дрожжах и изучили их клеточные эффекты. Эта система является простым инструментом для скрининга соединений или генов, проявляющих защитные роли против цитотоксичности α-синуклеина.
Protocol
Representative Results
Discussion
Учитывая сложность различных клеточных систем у человека, выгодно использовать дрожжи в качестве модели для изучения нейродегенеративных заболеваний человека. Хотя почти невозможно исследовать сложные клеточные взаимодействия человеческого мозга с использованием дрожжей, с точки ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джеймса Бардуэлла и Тьяго Ф. Аутейро за любезное распространение плазмид, содержащих α-синуклеин. Чанхан Ли получил финансирование от Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемого корейским правительством (MSIT) (грант 2021R1C1C1C1011690), Программы фундаментальных научных исследований через NRF, финансируемой Министерством образования (грант 2021R1A6A1A10044950), и нового исследовательского фонда факультета Университета Аджу.
Materials
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
- Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
- Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
- Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. Animal models of neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).
- Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
- Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. . Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
- Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).
- Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
- Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).
- Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson’s disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).
- Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson’s disease. PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).
- Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson’s disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson’s Disease. 2016, 1720621 (2016).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson’s disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111 (2020).
- Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).
