Un método para estudiar la toxicidad y agregación de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizado
Summary
Se requiere un modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína para estudiar y comprender la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. Describimos un método para monitorear la citotoxicidad y la formación agregada de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizada.
Abstract
La enfermedad de Parkinson es el segundo trastorno neurodegenerativo más común y se caracteriza por la muerte celular progresiva causada por la formación de cuerpos de Lewy que contienen α-sinucleína mal plegada y agregada. La α-sinucleína es una proteína presináptica abundante que regula el tráfico de vesículas sinápticas, pero la acumulación de sus inclusiones proteicas resulta en neurotoxicidad. Estudios recientes han revelado que varios factores genéticos, incluidas las chaperonas bacterianas, podrían reducir la formación de agregados de α-sinucleína in vitro. Sin embargo, también es importante controlar el efecto antiagregación en la célula para aplicar esto como un tratamiento potencial para los pacientes. Sería ideal usar células neuronales, pero estas células son difíciles de manejar y tardan mucho tiempo en exhibir el fenotipo antiagregación. Por lo tanto, se requiere una herramienta in vivo rápida y eficaz para la evaluación adicional de la actividad antiagregación in vivo. El método descrito aquí se utilizó para monitorear y analizar el fenotipo antiagregación en la levadura humanizada Saccharomyces cerevisiae, que expresaba α-sinucleína humana. Este protocolo demuestra herramientas in vivo que podrían usarse para monitorear la toxicidad celular inducida por α-sinucleína, así como la formación de agregados de α-sinucleína en las células.
Introduction
La enfermedad de Parkinson (EP) es un problema grave para las sociedades que envejecen en todo el mundo. La agregación de α-sinucleína está estrechamente asociada con la EP, y los agregados proteicos de α-sinucleína son ampliamente utilizados como biomarcador molecular para el diagnóstico de la enfermedad1. α-sinucleína es una pequeña proteína ácida (140 aminoácidos de longitud) con tres dominios, a saber, la α-hélice de unión a lípidos N-terminal, el dominio central de unión a amiloide (NAC) y la cola ácida C-terminal2. El plegamiento incorrecto de la α-sinucleína puede ocurrir espontáneamente y eventualmente conduce a la formación de agregados amiloides llamados cuerpos de Lewy3. α-sinucleína puede contribuir a la patogénesis de la EP de varias maneras. En general, se piensa que sus formas oligoméricas anormales y solubles llamadas protofibrillas son especies tóxicas que causan la muerte celular neuronal al afectar diversas dianas celulares, incluyendo la función sináptica3.
Los modelos biológicos utilizados para estudiar las enfermedades neurodegenerativas deben ser relevantes para los seres humanos con respecto a su genoma y biología celular. Los mejores modelos serían las líneas celulares neuronales humanas. Sin embargo, estas líneas celulares están asociadas a varios problemas técnicos, como dificultades en el mantenimiento de cultivos, baja eficiencia de la transfección y alto costo4. Por estas razones, se requiere una herramienta fácil y confiable para acelerar el progreso en esta área de investigación. Es importante destacar que la herramienta debe ser fácil de usar para analizar los datos recopilados. Desde estas perspectivas, varios organismos modelo han sido ampliamente utilizados, incluyendo Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, levadura y roedores5. Entre ellos, la levadura es el mejor organismo modelo porque la manipulación genética es fácil y es más barata que los otros organismos modelo. Lo más importante es que la levadura tiene altas similitudes con las células humanas, como un 60% de homología de secuencia con los ortólogos humanos y un 25% de homología cercana con los genes relacionados con enfermedades humanas6, y también comparten la biología fundamental de las células eucariotas. La levadura contiene muchas proteínas con secuencias similares y funciones análogas a las de las células humanas7. De hecho, la levadura que expresa genes humanos ha sido ampliamente utilizada como un sistema modelo para dilucidar los procesos celulares8. Esta cepa de levadura se llama levadura humanizada y es una herramienta útil para explorar la función de los genes humanos9. La levadura humanizada tiene mérito para estudiar las interacciones genéticas porque la manipulación genética está bien establecida en la levadura.
En este estudio, utilizamos la levadura Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo para estudiar la patogénesis de la EP, particularmente para investigar la formación de agregados de α-sinucleína y la citotoxicidad10. Para la expresión de α-sinucleína en la levadura en ciernes, se utilizó la cepa W303a para la transformación con plásmidos que codifican para las variantes de tipo salvaje y familiares asociadas a la PD de la α-sinucleína. Como la cepa W303a tiene una mutación auxotrófica en URA3, es aplicable para la selección de células que contienen plásmidos con URA3. La expresión de α-sinucleína codificada en un plásmido está regulada bajo el promotor GAL1. Por lo tanto, el nivel de expresión de α-sinucleína puede ser controlado. Además, la fusión de la proteína verde fluorescente (GFP) en la región C-terminal de la α-sinucleína permite el monitoreo de la formación de focos de α-sinucleína. Para comprender las características de las variantes familiares asociadas a la EP de la α-sinucleína, también expresamos estas variantes en levaduras y examinamos sus efectos celulares. Este sistema es una herramienta sencilla para la detección de compuestos o genes que exhiben funciones protectoras contra la citotoxicidad de la α-sinucleína.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dada la complejidad de varios sistemas celulares en humanos, es ventajoso utilizar la levadura como modelo para estudiar las enfermedades neurodegenerativas humanas. Aunque es casi imposible investigar las complejas interacciones celulares del cerebro humano utilizando levadura, desde una perspectiva unicelular, las células de levadura tienen un alto nivel de similitud con las células humanas en términos de homología de secuencia genómica y procesos celulares eucariotas fundamentales 8,1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a James Bardwell y Tiago F. Outeiro por compartir amablemente los plásmidos que contienen α-sinucleína. Changhan Lee recibió fondos de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIT) (subvención 2021R1C1C1011690), el Programa de Investigación de Ciencias Básicas a través del NRF financiado por el Ministerio de Educación (subvención 2021R1A6A1A10044950) y el nuevo fondo de investigación docente de la Universidad de Ajou.
Materials
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
- Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
- Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
- Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. Animal models of neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).
- Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
- Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. . Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
- Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).
- Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
- Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).
- Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson’s disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).
- Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson’s disease. PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).
- Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson’s disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson’s Disease. 2016, 1720621 (2016).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson’s disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111 (2020).
- Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).
