تم وصف بروتوكول قائم على صفيحة عيار دقيق مكون من 96 بئرا باستخدام مقايسة اختزال 2،3-مكرر (2-ميثوكسي-4-نيترو-5-سلفوفينيل) -5-كربوكسانيليد-2H-تيترازوليوم (XTT) هنا ، لدراسة تأثيرات الأجسام المضادة على الأغشية الحيوية التي شكلتها C. tropicalis. يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر للتحقق من تأثير المركبات المضادة للفطريات الجديدة المحتملة على النشاط الأيضي لخلايا أنواع المبيضات في الأغشية الحيوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مقايسة اختزال قابلة للذوبان تعتمد على التترازوليوم لتقييم تأثير الأجسام المضادة على الأغشية الحيوية المبيضات الاستوائية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أنواع المبيضات هي السبب الرابع الأكثر شيوعا لعدوى المستشفيات الجهازية. غالبا ما ينطوي داء المبيضات الجهازي أو الغازي على تكوين الأغشية الحيوية على الأجهزة المزروعة أو القسطرة ، والتي ترتبط بزيادة الفوعة والوفيات. تظهر الأغشية الحيوية التي تنتجها أنواع المبيضات المختلفة مقاومة معززة ضد الأدوية المضادة للفطريات المختلفة. لذلك ، هناك حاجة لتطوير علاجات مناعية فعالة أو علاجات مساعدة ضد الأغشية الحيوية المبيضات. في حين أن دور المناعة الخلوية راسخ في الحماية من المبيضات ، فقد تمت دراسة دور المناعة الخلطية بشكل أقل.
وقد افترض أن تثبيط تكوين الأغشية الحيوية ونضجها هو أحد الوظائف الرئيسية للأجسام المضادة الواقية ، وقد ثبت أن الأجسام المضادة للأنبوب الجرثومي المبيضات البيض (CAGTA) تثبط النمو في المختبر وتشكيل الأغشية الحيوية ل C. albicans في وقت سابق. تحدد هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لتقييم دور الأجسام المضادة على الأغشية الحيوية التي شكلتها C. tropicalis. تتضمن منهجية هذا البروتوكول تكوين الأغشية الحيوية C. tropicalis في 96 صفيحة ميكرومتر بئر ، والتي تم تحضينها بعد ذلك في وجود أو عدم وجود أجسام مضادة خاصة بالمستضد ، تليها مقايسة 2،3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) لقياس النشاط الأيضي للخلايا الفطرية في الغشاء الحيوي.
تم تأكيد الخصوصية باستخدام ضوابط المصل المناسبة ، بما في ذلك مصل Sap2 المستنفد للأجسام المضادة. تظهر النتائج أن الأجسام المضادة الموجودة في مصل الحيوانات المحصنة يمكن أن تمنع نضوج المبيضات الحيوية في المختبر. باختصار ، تقدم هذه الورقة رؤى مهمة فيما يتعلق بإمكانات الأجسام المضادة في تطوير علاجات مناعية جديدة وعلاجات تآزرية أو مساعدة ضد الأغشية الحيوية أثناء داء المبيضات الغازي. يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر للتحقق من تأثير المركبات المضادة للفطريات الجديدة المحتملة على النشاط الأيضي لخلايا أنواع المبيضات في الأغشية الحيوية.
المقدمة
داء المبيضات الجهازي هو السبب الرئيسي الرابع لعدوى المستشفيات ، والتي ترتبط بارتفاع معدلات المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. على الصعيد العالمي ، يؤثر داء المبيضات الجهازي على ما يقرب من 700000 فرد1. أنواع المبيضات ، وهي C. albicans ، C. tropicalis ، C. parapsilosis ، C. glabrata ، و C. auris، هي السبب الأكثر شيوعا لعدوى المبيضات الغازية2. أنواع المبيضات هي مسببات الأمراض الانتهازية التي تنتج الأغشية الحيوية3. ترتبط الأغشية الحيوية في الغالب بضراوة المبيضات ، ويمكن أن تتحمل المبيضات ظروف الإجهاد التأكسدي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إيواء الفئران BALB / c في مرفق الحيوانات الصغيرة في IIT Roorkee. تم الحفاظ على جميع الحيوانات في دورة 12 ساعة: 12 ساعة خفيفة: مظلمة عند 25 درجة مئوية وتم تزويدها بنظام غذائي بيليه وماء حسب الرغبة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية (IAEC) التابعة ل IIT Roorkee.
1. إعداد C. الاستوائية
ملاحظة: ينتمي فطر المبيضات الاستوائية إلى مسببات الأمراض من مجموعة المخاطر 2 ويصنف على أنه كائن حي دقيق BSL2. استخدم دائما خزانات السلامة البيولوجية المعتمدة من الفئة الثانية عند العمل مع أنواع المبيضات . ممارسة تقنيات التعقيم والعقم أث....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نمت الأغشية الحيوية Candida tropicalis في 96 لوحة معايرة دقيقة وتم تصويرها بمعدل 40x باستخدام مجهر مقلوب (الشكل 1 أ). تم تلطيخ الغشاء الحيوي باستخدام البنفسجي البلوري ولوحظ عند 40x باستخدام مجهر مقلوب (الشكل 1B). يظهر المجهر الإلكتروني الماسح صورة تمثيلية لغشاء حيوي C. tropicalis (الشكل 1C). لإجراء مقايسة تثبيط الأغشية الحيوية، أضيفت 105 خلايا من المبيضات إلى آبار صفيحة المعايرة الدقيقة المكونة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ترتبط الالتهابات الفطرية التي تسببها أنواع المبيضات بارتفاع معدلات المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. يتطلب التهديد المتزايد للعدوى الفطرية الغازية الإدارة المبكرة لمثل هذه الأمراض التي تهدد الحياة. تتضمن معظم عدوى المبيضات تكوين الأغشية الحيوية ، التي تلتصق بمجموعة متنوعة من الأجهزة الطبية وهي مسؤولة عن استمرار وتكرار الالتهابات الفطرية في المستشفيات31. تتكون الأغشية الحيوية من خلايا الخميرة أو الخلايا الفطرية ، وتظهر مقاومة كبيرة لغالبية الأدوية المضادة للفطريات التقليدية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة Ramalingaswami DBT-843-BIO (قسم التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند) وجائزة البحث الوظيفي المبكر SER-1058-BIO (مجلس أبحاث العلوم والهندسة ، حكومة الهند) إلى SR. يقر المؤلفون بمنحة ICMR-JRF إلى P.C ومنحة DBT-JRF إلى P.S. يشكر المؤلفون الدكتور رافيكانت رانجان على اقتراحاته بشأن المخطوطة والمساعدة الفنية التي قدمها السيد براديب سينغ ثاكور خلال SEM.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية | Falcon | 546021 | |
| 1x PBS | - | محضرة في المختبر | كلوريد الصوديوم : 4 جم KCl : 0.1 جم Na 2< / sub>HPO4< / sub>: 0.72 g KH2< sub>PO4< / sub> : 0.12 جم ماء 500 مل. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 |
| 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية | Falcon | 546041 | |
| ألواح الميكروتيتر ذات 96 بئرا حاضنة | Nunc | 442404 | |
| Generic | |||
| Menadione | Sigma | M5625 | |
| Microtiter Plate | Reader Generic | ||
| ماصة ونصائح متعددة القنوات | عامة | ||
| أطباق بتري | تارسون | 460090 | |
| رنجر لاكتات | محضرة في المختبر | كلوريد الصوديوم 0.6 جرام لاكتات الصوديوم 0.312 جرام كلوريد البوتاسيوم 0.035 جرام كلوريد الكالسيوم 0.027 جرام ماء 100 مل. اضبط على درجة الحموضة 7.0 ؛ | |
| RPMI 1640 MOPS | Himedia | AT180 | |
| Sabouraud dextrose Agar | SRL | 24613 | |
| مرق سكر العنب Sabouraud | SRL | 24835 | |
| XTT | Invitrogen | X6493 |
المراجع
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57(2017).
- Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Pri....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
