一种基于可溶性四氮唑还原反应的检测方法，用于评估抗体的作用效果 Candida tropicalis 生物膜

摘要

本文描述了一种基于96孔微孔板的实验方案，利用2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-5-羧基苯胺-2H-四唑（XTT）还原法检测抗体对C. tropicalis形成生物膜的影响。体外实验方案可用于检测潜在新型抗真菌化合物对Candida物种生物膜中细胞代谢活性的作用。

摘要

Candida 属是引起全身性医院内感染的第四大常见病因。全身性或侵袭性念珠菌病常涉及在植入装置或导管上形成生物膜，这与毒力增强和死亡率升高相关。不同 Candida 物种产生的生物膜对多种抗真菌药物表现出更强的耐药性。因此，亟需开发针对 Candida 生物膜的有效免疫疗法或辅助治疗手段。尽管细胞免疫在抗 Candida 防御中的作用已得到充分证实，但体液免疫的作用研究相对较少。

已有假说认为，抑制生物膜的形成与成熟是保护性抗体的主要功能之一， 白色念珠菌 菌丝管抗体（CAGTA）已被证明具有抑制作用 体外 生长与生物膜形成 C. albicans 较早前。本文概述了一种详细方案，用于评估抗体在由以下病原体形成的生物膜中的作用 C. tropicalis 本方案的方法学包括 C. tropicalis 在96孔微量滴定板中形成生物膜，随后在存在或不存在抗原特异性抗体的条件下进行孵育，然后采用2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-5-羧基酰胺-2H-四唑氮盐（XTT）检测法测定生物膜中真菌细胞的代谢活性。

通过使用适当的血清对照（包括Sap2特异性抗体耗竭血清）验证了特异性。结果表明，免疫动物血清中存在的抗体能够抑制 假丝酵母 生物膜成熟 体外总之，本文为抗体在侵袭性念珠菌病期间针对生物膜开发新型免疫疗法以及协同或辅助治疗方面的潜力提供了重要的见解。 体外 该方案可用于检测潜在新型抗真菌化合物对真菌代谢活性的影响 假丝酵母 生物膜中的物种细胞。

引言

系统性念珠菌病是全球医院内感染的第四大主要原因，与较高的发病率和死亡率相关。全球范围内，系统性念珠菌病影响约700,000人¹. 假丝酵母 物种，即 C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata， 和 C. auris最常见的侵入性病因 假丝酵母 感染². 假丝酵母 物种是能够形成生物膜的机会性病原体³生物膜主要与 假丝酵母 毒力，以及 假丝酵母 可通过诱导生物膜形成来耐受氧化和渗透胁迫条件⁴生物膜进一步调控毒力因子和细胞壁组分的表达，并形成一种胞外多糖保护基质，有助于 假丝酵母 以适应不同的宿主生态位⁴生物膜促进酵母在宿主组织和医疗器械表面的黏附⁵因此，生物膜的形成使酵母菌获得优势，因为生物膜内的酵母细胞能够逃逸宿主的免疫应答。⁶生物膜的形成还能使致病性酵母菌免受抗真菌药物的作用。⁵. 感染....

方案

BALB/c小鼠饲养于印度理工学院鲁尔基分校的小型动物实验中心。所有动物均在25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，并可自由摄取颗粒饲料和饮水。ad libitum。所有动物实验均经印度理工学院鲁尔基分校机构动物伦理委员会（IAEC）批准。

1. 准备 C. tropicalis

注意：真菌Candida tropicalis属于危险等级2级的病原体，被归类为生物安全等级2级（BSL2）微生物。在操作Candida属物种时，必须始终使用经认证的II级生物安全柜。处理C. tropicalis时应采用无菌和无菌操作技术，并遵循推荐的生物安全程序，妥善处置该病原体。

1. 划线 C. tropicalis （菌株 ATCC 750）接种至沙氏葡萄糖琼脂（SAB）平板上。
2. 制备过夜培养的菌液 C. tropicalis 通过将SAB琼脂平板上的单个菌落接种至含有10 mL SAB液体培养基的无菌50 mL锥形管中。或者，使用冻存的甘油菌种 C. tropicalis 并接种 100 µL 将甘油菌种接种至含有50 mL SAB液体培养基的无菌250 mL锥形瓶中。
3. 孵育 C....

结果

Candida tropicalis 生物膜在96孔微孔板中培养，并使用倒置显微镜在40倍下进行成像（图1A）。生物膜进一步用结晶紫染色，并使用倒置显微镜在40倍镜下观察（图1B）。扫描电子显微镜显示了一个代表性图像 C. tropicalis 生物膜图1C）。为进行生物膜抑制实验，加入10⁵ 细胞的 白色念珠菌 在时间0，按照布局将样品加入96孔微孔板的各孔中图2A）。24小时后，洗涤平板，并将血清样本加入预先形成的生物膜中。根据预实验和既往发表的研究，选择1:50的常规血清稀释度，以比较来自Sap2免疫小鼠和假免疫小鼠不同组别所获得的不同血清样本³⁰.

根据布局（图2B

讨论

由 Candida 属真菌引起的感染在全球范围内与高发病率和高死亡率相关。侵袭性真菌感染日益增长的威胁，要求对这类危及生命的疾病进行早期管理。大多数 Candida 感染涉及生物膜的形成，这些生物膜可黏附于多种医疗器械表面，并导致医院环境中真菌感染的持续存在和反复发生³¹。生物膜由酵母相或菌丝相细胞组成，对大多数传统抗真菌药物表现出显著的耐药性³²。Candida 生物膜的抗真菌耐药性与多种机制有关，包括抗真菌药物渗透性降低、胞外基质的存在、药物外排泵的过表达、细胞膜甾醇成分的改变、生长缓慢和空间异质性、多种信号通路的激活，以及耐药持久性细胞的存在^33,34。抑制 Candida 的黏附及生物膜形成是预防 Candida 感染最重要的策略。

各种 体外 细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥形离心管	BD Falcon	546021
1× PBS	—	实验室配制	NaCl：4 g KCl：0.1 g Na2HPO4：0.72 g  KH2PO4：0.12 g 水 500 mL。调节 pH 至 7.4
50 mL 圆锥形离心管	BD Falcon	546041
96 孔微量滴定板	Nunc	442404
培养箱	通用
甲萘醌	Sigma	M5625
微量滴定板读数仪	通用
多通道移液器及吸头	通用
培养皿	Tarson	460090
乳酸林格液	—	实验室配制	氯化钠 0.6 g，乳酸钠 0.312 g，氯化钾 0.035 g，氯化钙 0.027 g，水 100 mL。调节 pH 至 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
沙氏葡萄糖琼脂	SRL	24613
沙氏葡萄糖肉汤	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493