Summary
אנו מדווחים על תא סביבתי גמיש ומתקדם להדמיה בהילוך מהיר של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה זקוף עם זיהוי אותות משודרים. טיפות שומנים צולמו בתאי SKOV3 שטופלו בחומצה אולאית למשך עד 24 שעות במרווח זמן של 3 דקות.
Abstract
מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (SRS) הוא טכנולוגיית הדמיה כימית ללא תוויות. דימות תאים חיים עם SRS הוכח עבור יישומים ביולוגיים וביו-רפואיים רבים. עם זאת, הדמיית SRS ארוכת טווח בהילוך מהיר של תאים חיים לא אומצה באופן נרחב. מיקרוסקופ SRS משתמש לעתים קרובות ביעד טבילה במים עם צמצם מספרי גבוה (NA) ובמעבה טבילת שמן NA גבוה כדי להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה. במקרה זה, הפער בין המטרה לבין המעבה הוא רק כמה מילימטרים. לכן, רוב התאים הסביבתיים המסחריים אינם יכולים לשמש להדמיית SRS בגלל עוביים הגדול עם כיסוי זכוכית קשיח. מאמר זה מתאר את התכנון והייצור של תא גמיש שניתן להשתמש בו להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר עם זיהוי אותות SRS המשודרים במסגרת מיקרוסקופ זקוף. הגמישות של החדר מושגת באמצעות חומר רך - סרט גומי טבעי דק. ניתן להוסיף בקלות את המארז החדש ואת עיצוב התא למערך הדמיה SRS קיים. הבדיקות והתוצאות הראשוניות מראות כי מערכת התא הגמישה מאפשרת הדמיית SRS יציבה, ארוכת טווח ובהילוך מהיר של תאים חיים, אשר תוכל לשמש ליישומי הדמיה ביולוגית שונים בעתיד.
Introduction
מיקרוסקופ אופטי משמש להתבוננות במיקרו-מבנים של דגימות. הדמיה אופטית היא מהירה, פחות פולשנית ופחות הרסנית מטכנולוגיות אחרות1. דימות תאים חיים עם מיקרוסקופ אופטי פותח כדי ללכוד את הדינמיקה של תאים חיים בתרבית במשך תקופה ארוכה2. סוגים שונים של ניגודים אופטיים מספקים מידע ברור על דגימות ביולוגיות. לדוגמה, מיקרוסקופ פאזה אופטי מראה את ההבדל הדק במדדי השבירה על פני מדגם3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי נמצא בשימוש נרחב כדי לדמיין ביומולקולות ספציפיות או אברונים תאיים. עם זאת, ספקטרום העירור והפליטה בפס רחב של פלואורסצנטיות גורם בדרך כלל לחפיפה ספקטרלית כאשר מתבצעת הדמיה מרובת צבעים4. מולקולות פלואורסצנטיות רגישות לאור וניתן להלבין אותן לאחר חשיפה תקופתית ארוכת טווח לאור. בנוסף, תיוג פלואורסצנטי עשוי לשנות את הפיזור הביולוגי של המולקולות בתאים5. מיקרוסקופ SRS הוא טכנולוגיית הדמיה כימית ללא תוויות6. הניגודיות של SRS מסתמכת על מעבר רטט של קשרים כימיים ספציפיים. תדירות הרטט של קשר כימי מציגה לעתים קרובות רוחב פס ספקטרלי צר, מה שהופך את זה אפשרי לצלם רצועות ראמאן מרובות באותן דגימות7. מיקרוסקופ SRS הוא כלי ייחודי להדמיית תאים חיים, המספק ניגודים כימיים מרובים באופן נטול תוויות8.
בעוד שהדמיית SRS של תאים לא מוכתמים שימשה במחקרים רבים, הדמיית SRS ארוכת טווח בהילוך מהיר של תאים חיים לא אומצה באופן נרחב. אחת הסיבות לכך היא שלא ניתן להשתמש ישירות בתאים פתוחים מסחריים להדמיית SRS בגלל עוביים הגדול 9,10,11,12. תאים אלה עם מכסה זכוכית מתוכננים בעיקר עבור הדמיה של שדה בהיר או פלואורסצנטי באמצעות מטרת NA גבוהה אחת עם סכימת זיהוי לאחור. עם זאת, הדמיית SRS מעדיפה גילוי משודר הן באמצעות מטרת NA גבוהה והן באמצעות מעבה NA גבוה, אשר משאיר רק מרווח קצר מאוד (בדרך כלל כמה מילימטרים) בין המטרה לבין המעבה. כדי להתגבר על בעיה זו, תכננו תא גמיש באמצעות חומר רך כדי לאפשר הדמיית SRS בהילוך מהיר של תאים חיים באמצעות מסגרת מיקרוסקופ זקוף. בתכנון זה, מטרת טבילת המים הייתה סגורה בתא הרך ויכולה לנוע בחופשיות בתלת מימד למטרות מיקוד והדמיה.
הטמפרטורה האופטימלית לגידול רוב תאי היונקים היא 37 מעלות צלזיוס, בעוד שטמפרטורת החדר תמיד נמוכה ב -10 מעלות מכך. טמפרטורה גבוהה או נמוכה מ 37 °C יש השפעה דרמטית על קצב צמיחת התאים13. לכן, בקרת טמפרטורה של סביבת תרבית התא נדרשת במערכת דימות של תאים חיים. ידוע כי חוסר יציבות טמפרטורה יוביל לבעיות מיקוד במהלך הדמיה ארוכת טווח14. כדי להשיג סביבה יציבה של 37°C, בנינו תא מארז גדול שיכסה את כל מסגרת המיקרוסקופ, כולל שכבת בידוד תרמי מתחת למיקרוסקופ (איור 1). בתוך תא בקרת הטמפרטורה הגדול, התא הקטן והגמיש עוזר לשמור במדויק על הלחות הפיזיולוגית ועל רמת החומציות באמצעות זרימת האוויר המווסתת בתוספת 5% CO 2 (איור 2). הטמפרטורה והלחות של התאים נמדדו כדי לאשר שהתכנון הדו-תאי סיפק את תנאי תרבית התאים האופטימליים לצמיחת תאים בהדמיית SRS תקופתית ארוכת טווח (איור 3). לאחר מכן הדגמנו את היישום של המערכת עבור דימות בהילוך מהיר ומעקב אחר טיפות שומנים (LDs) בתאי סרטן SKOV3 (איור 4, איור 5 ואיור 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית המתחם הסביבתי במיקרוסקופ
הערה: המארז הסביבתי הגדול הזה של המיקרוסקופ משמש לשליטה בטמפרטורה של גוף המיקרוסקופ וסביבת ההדמיה שיש לייצב ב-37°C (איור 1A).
- סמן את מיקומי כפות הרגליים של מסגרת המיקרוסקופ SRS ואת השלב הממונע באמצעות עט סמן על השולחן האופטי. הרכיבו שתי דיאפרגמות איריס מול סורק הגלוונומטר של המיקרוסקופ והתכווננו כך שהמשאבה וקרני הלייזר של סטוקס יעברו דרך מרכז דיאפרגמת הקשתית.
- הסר את מסגרת המיקרוסקופ ואת הבמה מהטבלה האופטית.
- הניחו את יריעת גומי הסיליקון (גודל: 31X29 אינץ', עובי: 1/8 אינץ') על השולחן האופטי (איור 1B).
- חותכים את גומי הסיליקון לאורך הסימנים באמצעות סכין, מסירים חתיכות גומי קטנות ומניחים את יריעות הקרמיקה המרובעות MICA (גודל: 6X6 אינץ', עובי: 1/4 אינץ') באותם מיקומים.
הערה: MICA קרמי הוא חומר קל למכונה15. זה קשה כמו אלומיניום אבל הוא מבודד תרמי מעולה. יריעות קרמיות MICA שימשו לעצירת מעבר חום מהמסגרת והבמה של מיקרוסקופ המתכת אל השולחן האופטי מפלדת אל-חלד. יש לקדוח מספר חורי מעבר ביריעות MICA כדי לאפשר שימוש ב-1/4-20 ברגים להרכבת רגלי המסגרת והבמה. - הזיזו את מסגרת המיקרוסקופ ואת הבמה בחזרה לשולחן האופטי ויישרו בזהירות את כפות הרגליים על יריעות הקרמיקה של MICA לאורך קווי הסמן. השתמש 1/4-20 ברגים כדי להרכיב את המסגרת ואת הבמה על השולחן.
- יישר מחדש את הנתיב האופטי SRS. כוונן את תושבות המראה של מראה 1 ומראה 2 כדי לגרום לקרן הלייזר לעבור דרך המרכז של שתי דיאפרגמות הקשתית המותקנות מראש (איור 2).
הערה: פרטים טכניים של מיקרוסקופ SRS שנבנה במעבדה ושימש לעבודת ההדמיה הנוכחית של תאים חיים מתוארים קודם לכן16. רוחב הדופק של המשאבה וקורות סטוקס הוא ~ 3-4 ps עם פיזור מוט זכוכית. המערכת נשלטת באמצעות תוכנת ScanImage17 . - על גבי בסיס בידוד תרמי זה, הרכיבו את המארז הסביבתי כדי לכסות את כל מסגרת המיקרוסקופ באמצעות חמש חתיכות של יריעות פוליקרבונט גדולות (גודל: 31 x 29 x 28 אינץ ', עובי: 0.25 אינץ ').
הערה: גודל קופסת המארז נקבע בהתבסס על מידות מסגרת המיקרוסקופ והבמה. יהיה צורך להסיר את הלוח הקדמי של קופסת מארז המיקרוסקופ באופן זמני כדי להתקין את התא הגמיש ולטעון את צלחת תרבית התא.- כדי להרכיב את המארז, בצע עבודות עיבוד פשוטות, כולל חיתוך, קידוח והקשה על חורי בורג בכל קצה של יריעות הפוליקרבונט. חתכו שני חורים גדולים בקוטר של 2.6 אינץ 'בצד ימין ובצד שמאל של המארז כך שיתאימו לצינורות הכניסה והיציאה, בהתאמה. חותכים חור קטן בקוטר של 5 מ"מ על היריעה האחורית כדי לאפשר לקרני הלייזר להיכנס למארז.
- אטמו את הקצוות והממשקים של הקופסה באמצעות נייר אלומיניום.
- חבר את צינור התעלה הגמיש לכניסה וליציאות היציאה של תיבת המארז כדי לאפשר זרימת אוויר חם במחזור הנשאב ונשלט על ידי מודול המחמם. מקם את החיישן התרמי של מודול החימום בתא הגמיש שבו התאים מתורבתים ומצולמים. הגדר את טמפרטורת היעד על 37 °C (77 °F).
הערה: ניתן להשתמש בדיפיוזר כדי לקבל פיזור זרימת אוויר אחיד יותר במתחם הסביבתי.
2. הרכבת התא הגמיש
- הרכיבו את פיסת האלומיניום הגלילית החלולה 1 (חומר: אלומיניום 6061) על האף של המטרה באמצעות שלושה ברגים קבועים (איור 2).
- הרכיבו את פיסת האלומיניום הגלילית החלולה 2 במכונה למחזיק הדגימה באמצעות ארבעה ברגים 1/4-20 (איור 2).
הערה: יש לשנות את מחזיק הדגימה כך שיחזיק את צלחת תרבית התאים בתחתית הזכוכית בקוטר 50 מ"מ. קדח חור במרכז מחזיק הדגימה באמצעות מסור חור בגודל 1-7/8 אינץ '. נטרל את החור באמצעות מסור חור 50 מ"מ ושמור על עומק החור ~ 1 מ"מ. - התאימו את מחזיק הדגימה לחתיכת אלומיניום 2 על הבמה הממונעת והרכיבו אותו באמצעות ברגים.
- הניחו את שרוול סרט הגומי הטבעי (עובי: 0.01 אינץ'; מודבק בדבק ציאנואקרילט) בין שני חלקי האלומיניום המיוצרים במכונה והרכיבו אותו באמצעות גומיות בכל קצה.
- חבר את גליל CO2 דחוס למודול מערבל הגז באמצעות צינורות ומחברים מתאימים. הגדר את לחץ הכניסה CO2 על 20-25 psi. השתמש בחיישן CO2 מובנה ובבקר כדי להבטיח שמודול מערבל האוויר יכול לווסת ולערבב 5%CO2 בזרימת האוויר. השתמש במסננים מוטבעים כדי לנקות את זרימת האוויר.
- באמצעות צינורות ומחברים מתאימים, כוונו את האוויר המעורב (עם 5% CO2) לבקבוק המים המעוקרים שהונחו על הפלטה החשמלית, ולאחר מכן כוונו את האוויר הלח לתא הגמיש. כוונו את הפלטה החמה ל-37°C. בוערו את זרימת האוויר במים החמים כדי להגביר את הלחות של זרימת האוויר.
3. הכנה לניסויי הדמיה של SRS תאים חיים בהילוך מהיר
- נגבו את כל חלקי התא הגמיש באתנול 70%, כולל האף, מטרת טבילת המים ומחזיק הדגימה.
- לטהר את כל מערכת המארז באמצעות מנורת UV הממוקמת במארז למשך 20 עד 30 דקות.
הערה: אין להישאר בחדר המעבדה במהלך תהליך חיטוי UV מטעמי בטיחות. - תרבית תאי SKOV3 בצלחת פטרי בעלת תחתית זכוכית בקוטר 50 מ"מ למשך 12 שעות בתנאים פיזיולוגיים רגילים באינקובטור רגיל.
הערה: התחל את תרבית התאים SKOV318 בארון בטיחות ביולוגית סטנדרטי. - נתק את חתיכת האלומיניום המכונה 2 ממחזיק הדגימה על ידי הסרת הברגים.
הערה: זוהי הדרך לפתוח את התא הגמיש כדי לטעון את צלחת תרבית התא. - טוענים את צלחת תרבית התא. זכרו להוסיף שמן טבילה על החלק העליון של המעבה לפני הנחת צלחת תרבית התא. הסר את מכסה המנה ולשתק את המנה באמצעות מלחציים.
הערה: כדי למנוע זיהום, כל הפעולות צריכות להתבצע עם כפפות. - הנמיכו את המטרה למדיה של תרבית התאים למיקוד גס. מנמיכים את חתיכת האלומיניום 2 כדי לתחום את התא הגמיש ולהרכיב אותו על מחזיק הדגימה באמצעות ברגים.
הערה: כרית כרית גומי סיליקון 2 מ"מ מחוברת לתחתית חתיכת אלומיניום 2 כדי לאטום את הרווח בחוזקה. - הגדר את אספקת האוויר עם 5% CO 2 ו- 19% O2 לתרבית תאים רגילה עם קצב זרימת אוויר של 200 סמ"ק/דקה.
הערה: ניתן להשתמש בקצב זרימת אוויר נמוך יותר. זה תלוי כמה טוב החדר הגמיש אטום.
4. ערוך ניסויי הדמיה של SRS תאים חיים בהילוך מהיר
- כוונן את אורך גל הלייזר ל- 805 ננומטר כדי לכוון להיסטת ראמאן 2854 ס"מ-1 , המיוחסת לרטט של קשרים כימיים CH2 . השתמש בעוצמת לייזר נמוכה כדי להפחית את נזקי האור לתאים. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בהספק ממוצע ~ 15 mW של לייזר המשאבה ו~ 7.5 mW של לייזר סטוקס (קבוע ב- 1,045 ננומטר) להדמיית תאים חיים לטווח ארוך.
הערה: עוצמת לייזר גבוהה יותר תניב איכות הדמיה SRS טובה יותר. עם זאת, עוצמת לייזר גבוהה מדי תגרום נזק לאור לתאים חיים. יש פשרה בין איכות התמונה לבין נזקי האור. - התאם ומקד את המטרה כדי להשיג הדמיית SRS טובה של התאים באמצעות לחצן FOCUS בלוח הבקרה הראשי של התוכנה. כדי לבצע מיקוד מהיר, הגדר את מספר הפיקסלים להיות 512 × 512 פיקסלים עם זמן שהייה של 4.8 μs בחלונית CONFIGURATION .
- הגדר את טווח הכניסה של מגבר הנעילה (בדרך כלל 5 mV) להיות כפול ממתח האות המרבי. הגדר את המסנן במעבר נמוך כך שיהיה זהה לזמן השהייה של הפיקסלים (4.8 μs).
הערה: מערכות SRS שונות שנבנו במעבדה עשויות להשתמש בהגדרות שונות של איסוף נתונים. - לאחר השגת מיקוד טוב, הגדר את רזולוציית ההדמיה להיות 2,048 × 2,048 פיקסלים עבור שדה ראייה של175 מיקרומטר 2 לרכישת תמונות באיכות גבוהה. בדוק את הפונקציה SAVE בחלונית MAIN CONTROLS ובדוק את ערוץ SRS בחלונית CHANNELS . הגדר את מרווח הזמן בין שתי מסגרות ל- 180 שניות (3 דקות) בערוץ הפקדים הראשיים. הגדר את מספר הרכישה ל- 480 עבור הדמיה בהילוך מהיר במשך 24 שעות.
הערה: ניתן להשתמש ברזולוציית הדמיה נמוכה יותר בהתאם למטרת הניסויים. - הפעל רכישת הדמיה אוטומטית באמצעות הפונקציה LOOP בלוח הבקרה הראשי .
הערה: בדוק אם יש סחף מוקד עקב חוסר יציבות טמפרטורה בשעה הראשונה של ההדמיה. ייתכן שההדמיה של השעה הראשונה לא תהיה יציבה. בדוק את המיקוד כל 2-3 שעות במהלך סשן ההדמיה בהילוך מהיר. - עבד את התמונות שנאספו באמצעות ImageJ19. השתמש בשתי השיטות הבאות לכימות LD: (i) יחס שטח גוף התא LD/תא, ו- (ii) עוצמת SRS הממוצעת של LDs הכולל. מדוד את שטח גוף התא על-ידי סף ואפס של הפיקסלים הלא-תאיים בתמונות SRS ב- 2,854 cm-1. מדדו את האזור והעוצמה של LD באמצעות סף ואפס של פיקסלים שאינם LD בתמונות SRS.
הערה: פרטים נוספים על עיבוד תמונה SRS דווחו בעבר16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ייצרנו והרכבנו את מערכת התאים הגמישים להדמיית SRS בהילוך מהיר (איור 1 ואיור 2), ולאחר מכן הערכנו את ביצועי המערכת. הטמפרטורה בתוך המתחם הסביבתי של המיקרוסקופ הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס הצפויות בתוך שעה אחת, מה שלא השפיע באופן משמעותי על טמפרטורת החדר (איור 3A). הטמפרטורה בתא הגמיש הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס תוך שעה וחצי, והיא נשמרה ביציבות ב-37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לפחות (איור 3B). הלחות היחסית בתא הגמיש יכולה להגיע ל-85% תוך שעה אחת, ואז להישמר לפחות 24 שעות (איור 3C). נתוני הטמפרטורה והלחות שנמדדו מאשרים כי מערכת זו יכולה לספק סביבה אופטימלית לצמיחת תאים לטווח ארוך.
דימות תאים חיים עם SRS יושם במחקרים ביולוגיים וביו-רפואיים רבים 20,21,22,23,24. בפרט, הדמיית SRS של LDs ללא תוויות בתאים חיים כדי להבין את חילוף החומרים של שומנים בסרטן משכה תשומת לב רבה16,25,26. באמצעות מערכת התא הגמיש שתוכננה, ביצענו תחילה הדמיית SRS בהילוך מהיר של תאי SKOV3 חיים במשך 24 שעות עם מרווח זמן של 3 דקות (איור 4). נתוני הווידאו הראו את התנועה המהירה והפעילה של LDs תוך תאיים ברזולוציה זמנית של 3 דקות. בסוף סשן ההדמיה של 24 שעות, התאים עדיין הראו מורפולוגיה וצפיפות תקינות, מה שמצביע על כך שהתאים היו בריאים. לאחר מכן צילמנו תאי SKOV3 שטופלו בחומצה אולאית (OA) ועקבנו אחר התהליך הדינמי של הצטברות LD תוך 10 שעות (איור 5A).
כמויות ה-LD כומתו בתאי SKOV3 שטופלו ב-OA בשתי דרכים (יחס LD לשטח גוף התא ועוצמת SRS כוללת של ה-LDs) באמצעות ImageJ19. התוצאות מצביעות על כך שכמות ה-LDs (בגודל ובמספר) המשיכה לגדול במשך 10 שעות (איור 5B). הדגמנו גם דימות SRS קדמי סימולטני של LDs (פסאודו צבע ירוק) והדמיה פלואורסצנטית של שני פוטונים לאחור (TPF) של ליזוזומים (פסאודו צבע אדום) המסומנים בצבע פלואורסצנטי DND-189 (איור 6). יצוין כי ניתן להשתמש בהדמיה דו-מודאלית SRS/TPF כדי לנתח את הקולוקליזציה של שני תאים תאיים. בניסוי זה, רמה נמוכה מאוד של colocalization של LDs וליזוזומים נצפתה, אשר צוין על ידי אזורים צהובים קטנים. יחד, תוצאות אלה מראות כי מערכת התא הגמישה מאפשרת הדמיית SRS יציבה, ארוכת טווח ובהילוך מהיר של תאים חיים, אשר תוכל לשמש ליישומי הדמיה שונים בעתיד.
איור 1: מערכת התאים הגמישה להדמיית SRS בהילוך מהיר של תאים חיים. (A) סכמטי של מערכת התאים הגמישים להדמיית SRS בהילוך מהיר של תאים חיים. (B) התמונה משמאל מראה את שכבת הבידוד התרמי באמצעות יריעת גומי סיליקון ורפידות קרמיות MICA מתחת למסגרת המיקרוסקופ ולבמה. התמונה מימין מראה את מארז המיקרוסקופ הסביבתי ואת התא הגמיש. קיצורים: SRS = פיזור ראמאן מגורה; CCM = סנטימטרים מעוקבים לדקה. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סכמות ותמונות של התא הגמיש עם הנתיב האופטי SRS, המאפשר תנועה חופשית תלת-ממדית של מטרת טבילת המים לצורך מיקוד והדמיה. התמונות משמאל מראות את שני מודולי האלומיניום המעובדים במכונה מחוברים לאף מטרה מסחרית ומחזיק דגימה שונה. התמונות התחתונות מציגות את מערכת התא הגמיש להרכבה. קיצור: SRS = פיזור ראמאן מגורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: נתוני טמפרטורה ולחות של מארז המיקרוסקופ והחדר הגמיש. (A) נתוני הטמפרטורה הנמדדים של מארז המיקרוסקופ וטמפרטורת חדר המעבדה, עד 12 שעות. (B) נתוני הטמפרטורה הנמדדים (ממוצע של 37°C) בתוך התא הגמיש, עד 24 שעות. (C) נתוני הלחות היחסית שנמדדו (ממוצע של 85%) בתוך התא הגמיש, עד 24 שעות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: 24 פריימים מייצגים של הדמיית SRS בהילוך מהיר. הדמיית SRS בהילוך מהיר (2,854 ס"מ-1) של תאי SKOV3 חיים באמצעות התא הגמיש, עד 24 שעות. בניסוי זה נרשמו 480 פריימים במרווח זמן קבוע של 3 דקות. התאים גודלו בתרבית בתנאים רגילים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הדמיית SRS בהילוך מהיר וכימות טיפות שומנים. (A) מייצג 10 פריימים של דימות SRS בהילוך מהיר (ב-2,854 ס"מ-1) של תאי SKOV3 חיים שטופלו ב-500 מיקרומטר OA, עד 10 שעות, באמצעות התא הגמיש. בניסוי זה נרשמו 200 פריימים במרווח זמן קבוע של 3 דקות. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) כמות ה-LDs לעומת הזמן (0-10 שעות) כומתה בשתי דרכים (יחס שטח גוף התא LD/תא ועוצמת SRS כוללת של LDs) באמצעות פונקציית הסף ופונקציות ניתוח החלקיקים ב-ImageJ. קיצורים: SRS = ספקטרוסקופיית ראמאן מגורה; OA = חומצה אולאית; LDs= טיפות שומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: קיטועי זמן, SRS סימולטני והדמיה פלואורסצנטית של שני פוטונים עבור LDs וליזוזומים. קיטועי זמן, SRS סימולטני (2,854 ס"מ-1), והדמיה פלואורסצנטית של שני פוטונים עבור LDs (פסאודו צבע ירוק) וליזוזומים (אדום), עד שעתיים. התאים טופלו בצבע פלואורסצנטי (LysoSensor DND-189, 1 μM) במשך שעה אחת לפני ההדמיה. התמונות צולמו כל 3 דקות. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. נצפתה רמה נמוכה של לוקליזציה של LDs וליזוזומים, המסומנים בצבע הצהוב. קיצורים: SRS = ספקטרוסקופיית ראמאן מגורה; LDs= טיפות שומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיקרוסקופ SRS של תאים חיים בהילוך מהיר הוא טכניקת הדמיה חלופית למעקב אחר מולקולות באופן נטול תוויות. בהשוואה לתיוג פלואורסצנטי, הדמיית SRS אינה מלבינה פוטו, ומאפשרת ניטור ארוך טווח של מולקולות. עם זאת, נכון להיום, מערכת הדמיה של תאים חיים במיקרוסקופ SRS זקוף אינה זמינה מסחרית. בעבודה זו פותחה מערכת דימות תאים חיים עם קופסת מארז מיקרוסקופ יציבה מבודדת תרמית ותא רך פנימי גמיש כדי לאפשר דימות בהילוך מהיר SRS משודר. במערך זה, תיבת המארז הגדולה שומרת על יציבות טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, בעוד שהתא הרך הפנימי מספק אוויר לח כדי ליצור סביבת תרבית תאים אופטימלית. התא הפתוח הגמיש שהודגם בעבודה זו מאפשר זרימת עבודה פשוטה להדמיית SRS ארוכת טווח של תאים חיים. תאים שנזרעו בצלחת בעלת תחתית זכוכית יכולים להיות מוכנים תחילה ומתורבתים באינקובטור רגיל לפני העברתם לתא הגמיש על הבמה לצורך הדמיה. פתרון חלופי לביצוע הדמיית SRS של תאים חיים הוא שימוש בתא זרימה סגור, כולל פלטפורמות ציטומטריה מיקרופלואידית וזרימה27,28,29,30. ניתן לתכנן תא זרימה בעובי נמוך יותר. עם זאת, גידול תאים בתא זילוח יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית31.
סחף מוקד הוא בעיה נפוצה בדימות תאים חיים32. כתהליך מולטיפוטון, יצירת אותות SRS דורשת מיקוד הדוק של קרני הלייזר, ולכן מיקרוסקופ SRS רגיש מאוד לסחף מוקדי. חוסר יציבות טמפרטורה הוא גורם חיוני בגרימת סחף מוקדי. כדי לשפר את היציבות התרמית, המיקרוסקופ כולו היה מוקף בחומרי בידוד תרמי. עם זאת, בחלק ממפגשי ההדמיה, עדיין חווינו סחף מוקד לאחר 2-3 שעות של הדמיה. הדמיה מיקרוסקופית SRS רגישה גם לרטט, שעלול להרוס את המיקוד. שולחן אופטי נגד רעידות מסייע להפחית את הרטט כדי להשיג הדמיה יציבה. כדי לפתור את בעיית נדידת המוקד, בניסויים עתידיים ניתן לאמץ טכנולוגיות מיקוד אוטומטי33.
הליך החיטוי של מערכת ההדמיה הוא קריטי כדי למנוע זיהום של התאים, במיוחד עבור מטרת טבילת המים, אשר תבוא במגע ישיר עם מדיה תרבית התא. זה צריך להיות בטוח להשתמש באתנול 70% לניקוי החלק העליון של העדשה. מכיוון שאור UV יכול רק לחטא ביעילות את פני השטח של האובייקטים, ארבע מנורות UV הותקנו במקומות שונים בקופסת המארז כדי לבצע חיטוי בניסויים אלה. עם זאת, אור UV עלול לפרק את רכיבי הפלסטיק במערכת ההדמיה. במקרה זה, ניתן להשתמש ברדיד אלומיניום כדי לעטוף ולכסות את חלקי הפלסטיק. להדמיית תאים חיים, אנטיביוטיקה (בדרך כלל 100 יחידות/מ"ל פניצילין ו-100 מק"ג/מ"ל סטרפטומיצין בתרבית) מומלצת מאוד.
בניסויים אלה צילמנו וכימתנו את ה-LDs בתאי סרטן חיים. עבור ניסויים אלה, מרווח זמן של 3 דקות היה סביר. יצוין כי מרווח זמן ההדמיה יכול להשתנות בהתאם לצרכים של פרויקט המחקר. לדוגמה, כדי לעקוב אחר LD יחיד בתא חי, ייתכן שיהיה צורך במרווח זמן של פחות מדקה אחת. לעומת זאת, מרווח זמן ארוך יותר של כמה דקות מספיק כדי לעקוב אחר תהליכים ביולוגיים איטיים34.
הדמיית SRS משתמשת בעוצמת לייזר גבוהה יותר לעירור מאשר טכנולוגיות הדמיה אופטית רבות אחרות, מה שיכול להיות מאתגר עבור הדמיית SRS בהילוך ארוך טווח של תאים חיים. דימות SRS של הביומולקולות המקוריות מאתגר אפילו יותר בגלל חתך הרמאן הזעיר של הקשרים הכימיים35. בניסויים אלה נעשה שימוש בלייזר משאבה של 15 mW ב- 805 ננומטר ובלייזר סטוקס 7.5 mW ב- 1,045 ננומטר, ולא נצפה נזק משמעותי לאור תוך 24 שעות עם מרווח זמן של 3 דקות. השימוש בתגי ראמאן רגישים עלול להפחית עוד יותר את עוצמת הלייזר36 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות לצוות העיצוב הבכיר לתואר ראשון לשנת 2019 (סוק צ'ול יון, איאן פוקסטון, לואיס מאזה וג'יימס וולש) באוניברסיטת בינגהמטון על התכנון, הייצור והבדיקה של קופסת מארז המיקרוסקופ. אנו מודים לסקוט הנקוק, אולגה פטרובה ופביולה מורנו אוליבס מאוניברסיטת בינגהמטון על הדיונים המועילים. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R15GM140444.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
References
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T.
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. Methods in Cell Biology. (139), Elsevier. 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. Fluorescent Microscopy. , Springer. 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R.
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P.
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al.
