O-Ring-Aortenband versus traditionelle transversale Aortenverengung zur Modellierung von Drucküberlastung-induzierter Herzhypertrophie
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine neue Technik der Aortenbandbildung bei Mäusen, um eine Drucküberlastung der Herzhypertrophie zu induzieren. Zum Banderolieren wird ein Gummiring mit festem Innendurchmesser verwendet. Diese neue Technik verspricht weniger Varianz und reproduzierbarere Daten für zukünftige Experimente.
Abstract
Aortenbanding bei Mäusen ist eines der am häufigsten verwendeten experimentellen Modelle für Herzdrucküberlastung induzierte Herzhypertrophie und die Induktion von Herzinsuffizienz. Die bisher verwendete Technik basiert auf einer Fädelnaht um den Aortenbogen, die über eine abgestumpfte 27 G-Nadel gebunden wird, um eine Stenose zu erzeugen. Diese Methode hängt davon ab, dass der Chirurg den Faden manuell festzieht und führt somit zu einer hohen Varianz in der Durchmessergröße. Eine neu verfeinerte Methode, die von Melleby et al. beschrieben wurde, verspricht weniger Varianz und mehr Reproduzierbarkeit nach der Operation. Die neue Technik, O-Ring-Aortenband (ORAB), verwendet einen rutschfesten Gummiring anstelle einer Naht mit einem Faden, was zu einer reduzierten Variation der Drucküberlastung und reproduzierbaren Phänotypen der Herzhypertrophie führt. Während der Operation wird der O-Ring zwischen den brachiozephalen und linken Halsschlagadern platziert. Die erfolgreiche Verengung wird durch Echokardiographie bestätigt. Nach 1 Tag führt die korrekte Platzierung des Rings zu einer erhöhten Strömungsgeschwindigkeit in der Queraorta gegenüber der O-Ring-induzierten Stenose. Nach 2 Wochen wird eine beeinträchtigte Herzfunktion durch verminderte Ejektionsfraktion und erhöhte Wandstärke nachgewiesen. Wichtig ist, dass ORAB neben einer geringeren Varianz in der Durchmessergröße mit niedrigeren intra- und postoperativen Mortalitätsraten im Vergleich zur transversalen Aortenkonstriktion (TAC) verbunden ist. Somit stellt ORAB eine überlegene Methode gegenüber der häufig verwendeten TAC-Operation dar, was zu reproduzierbaren Ergebnissen und einer möglichen Reduzierung der Anzahl der benötigten Tiere führt.
Introduction
Während physiologische Herzhypertrophie während der Entwicklung, des Trainings und der Schwangerschaft beobachtet werden kann, reagiert die pathologische Herzhypertrophie auf hämodynamische Stresszustände wie arterielle Hypertonie, Herzklappenerkrankungen oder Genmutationen. Zunächst wird das Herz einem Umbau unterzogen, der durch eine erhöhte Kardiomyozytengröße und eine Verdickung der Ventrikelwände gekennzeichnet ist, um die Herzfunktion aufrechtzuerhalten 1,2. Auf der anderen Seite ist ein pathologischer Herzumbau mit einem erhöhten Risiko für Arrhythmie, plötzlichen Tod und hohe Mortalität verbunden. Schließlich führt dies mit der Zeit zu einer ventrikulären Dilatation, einer starken Abnahme der kontraktilen Funktion und schließlich zu einer Progression zur Herzinsuffizienz (HF), die mit hoher Morbidität, Mortalität und gesellschaftlichen Kosten verbunden ist3. Daher ist es dringend notwendig, die molekularen Hintergründe zu verstehen, um neue therapeutische Strategien zu entwickeln4.
Aortenbanding ist ein Modell, das Drucküberlastung induzierte linksventrikuläre (LV) Hypertrophie und Herzinsuffizienz bei Mäusennachahmt 5. Mit dieser Methode ist es möglich, die Pathomechanismen des Drucküberlastung-induzierten kardialen Umbaus in vivo zu untersuchen. Das erste Aortenbanding-Verfahren bei Mäusen wurde von Rockman et al.6 beschrieben. Die Drucküberlastung wird durch eine fadennahtbasierte Ligatur um die Aorta (zwischen der brachiozephalen und der linken gemeinsamen Halsschlagader) induziert. Um eine Stenose mit einem Durchmesser von 0,4 mm zu erzeugen, wird eine Naht um eine 27 G Nadel und die Aorta gelegt. Nach der Ligatur wird die Nadelentfernt 6,7.
Obwohl der Nadeldurchmesser fest ist, hängt die Dichtheit des Fadens stark vom Chirurgen ab und beeinflusst daher den induzierten Phänotyp der Herzhypertrophie. Darüber hinaus gibt es bei der faden-/nahtbasierten Methode einen variablen Grad des Stenosedurchmessers nach der Operation, verbunden mit einer hohen Varianz der Mortalität 8,9. Darüber hinaus ist das Training dieser Methode eine Herausforderung, insbesondere in Bezug auf das Finden des richtigen Niveaus und der Konsistenz beim Anziehen des Fadens. Schließlich kommt es zu Beginn des Trainings zu einer hohen intra- und postoperativen Mortalität aufgrund einer Störung der Aorta oder einer anderen Gewebeverletzung sowie zu einer hohen Variation des Ausmaßes der Stenose bei den überlebenden Tieren.
Kürzlich wurde ein optimiertes Verfahren der Aortenbandbildung von Melleby et al.10 beschrieben. Sie präsentierten die ORAB-Methode (O-Ring-Aortenbanding) mit geringerer Stenosevarianz und hochreproduzierbarer Drucküberlastung durch Verwendung eines rutschfesten Gummi-O-Rings mit einem festen Innendurchmesser von 0,71 mm, 0,66 mm und 0,61 mm. Kurz gesagt, der O-Ring wird aufgeschnitten, um den aufsteigenden Bogen gelegt und durch Fäden wieder geschlossen. Andere Wissenschaftler, die diese O-Ringe verwendeten, berichteten über eine geringere Variabilität der induzierten Herzhypertrophie9. Sie beobachteten auch eine intra- und postoperative Mortalität sowie eine bessere Reproduzierbarkeit und geringere Varianz im induzierten hypertrophen Phänotyp 9,11. Der vorliegende Artikel beschreibt die Vorgehensweise dieser einzigartigen Strategie in einem Schritt-für-Schritt-Protokoll. Das in diesem Bericht geteilte Fachwissen wird anderen Wissenschaftlern helfen, ihre Techniken auf diesem Gebiet zu verbessern.
Um eine Herzhypertrophie zu induzieren, die nach 6 Wochen zu Herzinsuffizienz führt, werden 12 Wochen alte männliche C57BL / 6N-Mäuse für die Operation empfohlen. Ein Vergleich 2 Wochen nach der Aortenbandbildung zwischen den Maussubstämmen C57BL/6N und C57BL/6J zeigte eine schwere kardiale Dysfunktion und eine damit verbundene erhöhte Mortalität bei C57BL/6N-Mäusen. Daher eignen sich diese besser für Modelle der Herzinsuffizienz12. Zwölfwochen alte männliche und weibliche Mäuse haben eine optimale Größe für die Exposition der Aorta und die Platzierung des O-Rings mit speziellen Instrumenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Faden-/Naht-basiertes Aortenband wird seit vielen Jahren verwendet, um eine Drucküberlastung der Herzhypertrophie bei Mäusen zu induzieren. Es ist eine etablierte Methode, um die Pathomechanismen des kardialen Umbaus und des Krankheitsverlaufs in vivo zu untersuchen. Die Einschränkungen sind die relativ hohe Varianz im Stenosengrad und folglich der Umbau. Die kürzlich eingeführte ORAB-Technik, die erstmals von Melleby et al.10 beschrieben wurde, optimiert die herkömmliche Methode d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) an L.L., N.F. und O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).
Materials
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
References
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