في المختبر طريقة لدراسة الاختلافات الجنسية في الخلايا الكأسية الملتحمة
Summary
يعد الوسط الخالي من الفينول الأحمر / الخالي من مصل الجنين البقري خيارا أفضل من RPMI المتقدم للتخلص من الهرمونات الخارجية دون تغيير الوظيفة الطبيعية لخلايا كأس الملتحمة في دراسة الاختلافات القائمة على الجنس.
Abstract
جفاف العين هو مرض متعدد العوامل يؤثر على صحة سطح العين ، مع انتشار أعلى بشكل كبير لدى النساء. يساهم اضطراب الميوسين المكون للهلام الذي تفرزه الخلايا الكأسية الملتحمة (CGCs) على سطح العين في أمراض سطح العين المتعددة. يعد التخلص من الهرمونات الجنسية الخارجية أمرا ضروريا للحصول على نتائج متسقة أثناء الدراسة المختبرية للاختلافات القائمة على الجنس في CGCs. تصف هذه الورقة طريقة لتقليل وجود الهرمونات الخارجية في دراسة الاختلافات القائمة على الجنس في CGCs مع الحفاظ على وظيفتها الفسيولوجية. تم استزراع CGCs من المتبرعين البشريين بعد الوفاة من كلا الجنسين من قطع من الملتحمة في وسط RPMI مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (يشار إليه باسم الوسط الكامل) حتى التقاء. قبل ما يقرب من 48 ساعة من بدء التجارب ، تم نقل CGCs إلى وسط RPMI بدون الفينول الأحمر أو FBS ولكن مع 1٪ BSA (يشار إليه باسم الوسط الخالي من الفينول الأحمر). تمت دراسة الوظيفة الخلوية الطبيعية عن طريق قياس الزيادة في تحفيز [Ca 2+] ([Ca 2+] i) داخل الخلايا بعد تحفيز الكرباكول (Cch ، 1 × 10-4 M) باستخدام المجهر fura 2 / acetoxymethyl (AM). أظهرت النتيجة أن CGCs حافظت على الوظيفة الطبيعية في الوسائط الخالية من الفينول الأحمر بعد 48 ساعة. لم يلاحظ فرق كبير في استجابة [Ca2+]i بين وسط RPMI الخالي من الفينول الأحمر والوسط الكامل عند تحفيز Cch. لذلك ، نوصي باستخدام وسيط RPMI الخالي من الفينول الأحمر مع 1٪ BSA للتخلص من الهرمونات الخارجية دون تغيير الوظيفة الطبيعية ل CGCs في دراسة الاختلافات القائمة على الجنس.
Introduction
تؤثر الاختلافات القائمة على الجنس على عمليات متعددة لسطح العين1،2،3. المظهر السريري لهذه الاختلافات القائمة على الجنس هو الاختلاف في انتشار العديد من أمراض سطح العين بين الرجال والنساء ، مثل جفاف العين والتهاب الملتحمة4،5،6. تشير الدلائل إلى أن الاختلافات القائمة على الجنس تنشأ من مستويات بيولوجية متعددة ، بما في ذلك الملامح المختلفة للجينات على كروموسومات X و Y7 وتأثيرات الهرمونات8. يمكن أن توفر دراسة الأساس الجزيئي للاختلافات القائمة على الجنس فهما أفضل للمرض ، وفي النهاية ، تحسين الطب الشخصي.
يتكون سطح العين من الغشاء المسيل للدموع والقرنية والملتحمة. لوحظت الاختلافات القائمة على الجنس في مكونات متعددة من سطح العين ، بما في ذلك الفيلم المسيل للدموع9،10 ، والقرنية11 ، والغدة الدمعية 12،13 ، وغدد ميبوميان التي تفرز أيضا الدموع 12. حققت العديد من الدراسات الميكانيكية في تأثير الهرمونات الجنسية على القرنية والمكونات المرتبطة بها14,15 ؛ ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن الاختلافات القائمة على الجنس في الملتحمة وخلاياها الكأسية. الملتحمة هي غشاء مخاطي يغطي الصلبة والسطح الداخلي للجفن. تتكون ظهارة الملتحمة من خلايا حرشفية طبقية غير كيراتينيةمتعددة الطبقات 16.
من بين الخلايا الحرشفية الطبقية للملتحمة ، توجد خلايا كأسية (CGCs) تتخللها على السطح القمي للظهارة. تتميز هذه الخلايا الكأسية بعدد كبير من الحبيبات الإفرازية الموجودة في القطب القمي17. تقوم CGCs بتصنيع وإفراز الميوسين المكون للهلام MUC5AC لترطيب سطح العين وتليينه أثناء الوميض17. يتم تنظيم إفراز الميوسين بإحكام بواسطة [Ca 2+] ([Ca2+] i) وتنشيط كيناز تنظيم الإشارة خارج الخلية المعتمد على Ras (ERK1 / 2) 18. عدم القدرة على إفراز الميوسين يؤدي إلى جفاف سطح العين وعقابيل التشوهات المرضية. ومع ذلك ، على سطح العين الملتهب ، يؤدي إفراز الميوسين المكثف الذي يحفزه الوسطاء الالتهابيون إلى إدراك الالتصاق والحكة في العين19. هذه الظروف مع إفراز الميوسين المضطرب ستؤدي في النهاية إلى تدهور سطح العين.
منذ فترة طويلة تم التعرف على دور الخلايا الكأسية كمصدر رئيسي للميوسين العيني20 ، ومع ذلك ، فإن الاختلافات القائمة على الجنس في تنظيم الميوسين في كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية لا تزال غير مكتشفة. سيكون النظام في المختبر مفيدا لمراقبة وظيفة الخلايا الكأسية دون التأثير الهرموني أو بمستوى متحكم فيه بدقة من الهرمونات الجنسية. على الرغم من أن خط الخلية الطلائية الملتحمة قد طور21 ، لا يوجد خط خلية كأسية مع إفراز الميوسين الوظيفي المتاح. لذلك ، قمنا بتعديل ثقافة CGC البشرية الأولية المتقدمة لدينا لإنشاء طريقة لتحليل الاختلاف القائم على الجنس في المختبر16 ، وتقديمه على النحو التالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يساعد التحقيق في الاختلافات القائمة على الجنس في أنسجة العين على فهم عمليات الأمراض ، وخاصة جفاف العين والتهاب الملتحمة التحسسي ، والتي تؤثر بشكل غير متناسب على جنس واحد4،5،6. على الرغم من أنه يمكن استخدام النماذج الحيوانية لهذه الدراسات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل العمل من قبل منحة المعهد الوطني للعيون EY019470 (D.A.D).
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians’ Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -. H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen’s and progesterone’s impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
