In vitro Metodo per studiare le differenze basate sul sesso nelle cellule caliciformi congiuntivali
Summary
Il terreno privo di fenolo rosso/siero fetale bovino è un’opzione migliore rispetto all’RPMI avanzato per eliminare gli ormoni esogeni senza alterare la normale funzione delle cellule caliciformi congiuntivali nello studio delle differenze basate sul sesso.
Abstract
L’occhio secco è una malattia multifattoriale che colpisce la salute della superficie oculare, con una prevalenza profondamente più elevata nelle donne. La rottura della mucina gelificante secreta dalle cellule caliciformi congiuntivali (CGC) sulla superficie oculare contribuisce a molteplici malattie della superficie oculare. L’eliminazione degli ormoni sessuali esogeni è essenziale per ottenere risultati coerenti durante lo studio in vitro delle differenze basate sul sesso nei CGC. Questo articolo descrive un metodo per ridurre al minimo la presenza di ormoni esogeni nello studio delle differenze basate sul sesso nei CGC mantenendo la loro funzione fisiologica. I CGC di donatori umani post-mortem di entrambi i sessi sono stati coltivati da pezzi della congiuntiva in terreno RPMI con il 10% di siero fetale bovino (FBS) (indicato come il terreno completo) fino alla confluenza. Circa 48 ore prima dell’inizio degli esperimenti, i CGC sono stati trasferiti in un terreno RPMI senza rosso fenolo o FBS ma con l’1% di BSA (indicato come mezzo privo di rosso fenolo). La normale funzione cellulare è stata studiata misurando l’aumento della stimolazione intracellulare [Ca2+] ([Ca2+]i) dopo stimolazione con carbacolo (Cch, 1 x 10-4 M) utilizzando la microscopia fura 2/acetossimetile (AM). Il risultato mostra che i CGC hanno mantenuto la normale funzione nei terreni privi di rosso fenolo dopo 48 ore. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nella risposta [Ca2+]i tra il terreno RPMI privo di rosso fenolo e il terreno completo dopo stimolazione Cch. Pertanto, si consiglia di utilizzare il terreno RPMI privo di rosso fenolo con l’1% di BSA per eliminare gli ormoni esogeni senza alterare la normale funzione dei CGC nello studio delle differenze basate sul sesso.
Introduction
Le differenze basate sul sesso influenzano molteplici processi della superficie oculare 1,2,3. La manifestazione clinica di queste differenze basate sul sesso è la differenza nella prevalenza di molte malattie della superficie oculare tra uomini e donne, come l’occhio secco e la congiuntivite 4,5,6. L’evidenza suggerisce che le differenze basate sul sesso derivano da più livelli biologici, compresi i diversi profili dei geni sui cromosomi X e Y7 e gli effetti degli ormoni8. Studiare le basi molecolari delle differenze basate sul sesso può fornire una migliore comprensione della malattia e, infine, migliorare la medicina personalizzata.
La superficie oculare comprende il film lacrimale sovrastante, la cornea e la congiuntiva. Le differenze basate sul sesso sono osservate in più componenti della superficie oculare, tra cui il film lacrimale 9,10, la cornea 11, la ghiandola lacrimale 12,13 e le ghiandole di Meibomio che secernono anche lacrime 12. Numerosi studi meccanicistici hanno indagato l’effetto degli ormoni sessuali sulla cornea e sui suoi componenti associati14,15; Tuttavia, si sa poco sulle differenze basate sul sesso nella congiuntiva e nelle sue cellule caliciformi. La congiuntiva è una membrana mucosa che ricopre la sclera e la superficie interna della palpebra. L’epitelio della congiuntiva è costituito da cellule squamose stratificate, multistrato e non cheratinizzanti16.
Tra le cellule squamose stratificate della congiuntiva, ci sono cellule caliciformi (CGC) sparse sulla superficie apicale dell’epitelio. Queste cellule caliciformi sono caratterizzate dal gran numero di granuli secretori situati al polo apicale17. I CGC sintetizzano e secernono la mucina gelificante MUC5AC per idratare la superficie oculare e lubrificarla durante il battito delle palpebre17. La secrezione di mucina è strettamente regolata dalla [Ca 2+] intracellulare ([Ca2+]i) e dall’attivazione della chinasi regolata dal segnale extracellulare Ras-dipendente (ERK1/2)18. L’incapacità di secernere mucina provoca secchezza della superficie oculare e sequele di anomalie patologiche. Su una superficie oculare infiammata, tuttavia, un’estesa secrezione di mucina stimolata da mediatori dell’infiammazione porta a una percezione di viscosità e prurito dell’occhio19. Queste condizioni con una secrezione di mucina disturbata alla fine porteranno al deterioramento della superficie oculare.
Il ruolo delle cellule caliciformi come principale fonte di mucina oculare è stato a lungo riconosciuto20, tuttavia, le differenze basate sul sesso nella regolazione della mucina sia negli stati fisiologici che patologici rimangono sconosciute. Un sistema in vitro sarebbe utile per monitorare la funzione delle cellule caliciformi senza l’effetto ormonale o con un livello di ormoni sessuali controllato con precisione. Anche se una linea cellulare epiteliale congiuntivale ha sviluppato21, non esiste una linea cellulare a calici con secrezione funzionale di mucina. Pertanto, abbiamo modificato la nostra coltura CGC umana primaria sviluppata per stabilire un metodo per analizzare la differenza basata sul sesso in vitro16 e presentarla come di seguito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiare le differenze basate sul sesso nei tessuti oculari aiuta a comprendere i processi delle malattie, in particolare l’occhio secco e la congiuntivite allergica, che colpiscono in modo sproporzionato un sesso 4,5,6. Anche se i modelli animali possono essere utilizzati per questi studi, i dati ottenuti direttamente dal tessuto umano sono essenziali a causa della massima somiglianza con le cellule umane in vivo. I te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è finanziato dal National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D.).
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
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