In vitro Méthode d’étude des différences fondées sur le sexe dans les cellules caliciformes conjonctivales
Summary
Le milieu sans sérum de veau fœtal sans rouge de phénol est une meilleure option que le RPMI avancé pour éliminer les hormones exogènes sans altérer la fonction normale des cellules caliciformes conjonctivales dans l’étude des différences basées sur le sexe.
Abstract
La sécheresse oculaire est une maladie multifactorielle affectant la santé de la surface oculaire, avec une prévalence profondément plus élevée chez les femmes. La perturbation de la mucine gélifiante qui est sécrétée par les cellules caliciformes conjonctivales (CGC) sur la surface oculaire contribue à de multiples maladies de la surface oculaire. L’élimination des hormones sexuelles exogènes est essentielle pour obtenir des résultats cohérents lors de l’étude in vitro des différences entre les sexes dans les CCG. Cet article décrit une méthode permettant de minimiser la présence d’hormones exogènes dans l’étude des différences fondées sur le sexe dans les CGC tout en maintenant leur fonction physiologique. Des CGC provenant de donneurs humains post-mortem des deux sexes ont été cultivés à partir de morceaux de conjonctive dans un milieu RPMI avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) (appelé milieu complet) jusqu’à la confluence. Près de 48 h avant le début des expériences, les CCG ont été transférés dans un milieu RPMI sans rouge de phénol ni FBS, mais avec 1 % de BSA (appelé milieu sans rouge de phénol). La fonction cellulaire normale a été étudiée en mesurant l’augmentation de la stimulation intracellulaire [Ca2+] ([Ca2+]i) après stimulation par carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) à l’aide de la microscopie fura 2/acétoxyméthyle (AM). Le résultat montre que les CCG ont maintenu un fonctionnement normal dans le milieu sans rouge de phénol après 48 h. Aucune différence significative dans la réponse [Ca2+]i n’a été observée entre le milieu RPMI sans rouge de phénol et le milieu complet lors de la stimulation de Cch. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser le milieu RPMI sans phénol avec 1% de BSA pour éliminer les hormones exogènes sans altérer le fonctionnement normal des CGC dans l’étude des différences basées sur le sexe.
Introduction
Les différences fondées sur le sexe affectent de multiples processus de la surface oculaire 1,2,3. La manifestation clinique de ces différences fondées sur le sexe est la différence de prévalence de nombreuses maladies de la surface oculaire entre les hommes et les femmes, telles que la sécheresse oculaire et la conjonctivite 4,5,6. Les preuves suggèrent que les différences fondées sur le sexe proviennent de plusieurs niveaux biologiques, y compris les différents profils de gènes sur les chromosomes X et Y7 et les effets des hormones8. L’étude des bases moléculaires des différences fondées sur le sexe peut permettre de mieux comprendre la maladie et, éventuellement, d’améliorer la médecine personnalisée.
La surface oculaire comprend le film lacrymal sus-jacent, la cornée et la conjonctive. Des différences fondées sur le sexe sont observées dans plusieurs composants de la surface oculaire, y compris le film lacrymal 9,10, la cornée 11, la glande lacrymale 12,13 et les glandes de Meibomius qui sécrètent également des larmes 12. De nombreuses études mécanistiques ont étudié l’effet des hormones sexuelles sur la cornée et ses composants associés14,15 ; Cependant, on sait peu de choses sur les différences entre les sexes dans la conjonctive et ses cellules caliciformes. La conjonctive est une muqueuse qui recouvre la sclérotique et la surface interne de la paupière. L’épithélium de la conjonctive est composé de cellules squameuses stratifiées, multicouches et non kératinisées16.
Parmi les cellules pavimenteuses stratifiées de la conjonctive, il y a des cellules caliciformes (CGC) intercalées à la surface apicale de l’épithélium. Ces cellules caliciformes sont caractérisées par le grand nombre de granules sécrétoires situés au pôle apical17. Les CGC synthétisent et sécrètent la mucine gélifiante MUC5AC pour hydrater la surface oculaire et la lubrifier pendant le clignement des yeux17. La sécrétion de mucine est étroitement régulée par le [Ca 2+] intracellulaire ([Ca2+]i) et l’activation de la kinase régulée par le signal extracellulaire dépendant de Ras (ERK1/2)18. L’incapacité à sécréter de la mucine entraîne une sécheresse de la surface oculaire et des séquelles d’anomalies pathologiques. Sur une surface oculaire enflammée, cependant, une sécrétion importante de mucine stimulée par des médiateurs inflammatoires entraîne une perception d’adhérence et de démangeaisons de l’œil19. Ces conditions avec une sécrétion de mucine perturbée finiront par entraîner une détérioration de la surface oculaire.
Le rôle des cellules caliciformes en tant que principale source de mucine oculaire est reconnu depuis longtemps20, cependant, les différences fondées sur le sexe dans la régulation de la mucine dans les états physiologiques et pathologiques restent à découvrir. Un système in vitro serait utile pour surveiller la fonction des cellules caliciformes sans effet hormonal ou avec un niveau d’hormones sexuelles précisément contrôlé. Même si une lignée cellulaire épithéliale conjonctivale s’est développée21, il n’existe pas de lignée cellulaire caliciforme avec une sécrétion de mucine fonctionnelle. Par conséquent, nous avons modifié notre culture de CCG humaine primaire développée pour établir une méthode d’analyse de la différence fondée sur le sexe in vitro16, et la présenter comme ci-dessous.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étude des différences entre les sexes dans les tissus oculaires aide à comprendre les processus des maladies, en particulier la sécheresse oculaire et la conjonctivite allergique, qui affectent de manière disproportionnée un sexe 4,5,6. Même si des modèles animaux peuvent être utilisés pour ces études, les données obtenues directement à partir de tissus humains sont essentielles en raison de la plus grande simil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux sont financés par le National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
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