אוסף של שורש אלפלפה מפריש כדי לחקור את ההשפעה של di(2-ethylhexyl) פתלאט על ייצור מטבוליטים
Summary
הפרשת ההפרשה של שורשים היא בדרך כלל אסטרטגיית ניקוי רעלים חיצונית לצמחים בתנאי עקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את ההשפעה של קסנוביוטיקה על אספסת באמצעות ניתוח מטבולי לא ממוקד.
Abstract
הפרשות שורשים הן המדיה העיקרית של תקשורת מידע והעברת אנרגיה בין שורשי הצמח לסביבה. השינוי בהפרשת ההפרשה של שורשים הוא בדרך כלל אסטרטגיית ניקוי רעלים חיצונית לצמחים בתנאי עקה. פרוטוקול זה נועד להציג הנחיות כלליות לאיסוף הפרשות שורש אספסת כדי לחקור את ההשפעה של di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) על ייצור מטבוליטים. ראשית, שתילי אספסת גדלים תחת לחץ DEHP בניסוי תרבית הידרופונית. שנית, הצמחים מועברים לצינורות צנטריפוגות המכילים 50 מ”ל מים אולטרה-טהורים מעוקרים למשך 6 שעות כדי לאסוף הפרשות שורשים. לאחר מכן התמיסות מיובשות בהקפאה במייבש בהקפאה בוואקום. הדגימות הקפואות מופקות ומפורקות באמצעות מגיב bis(trimethylsilyl)) trifluoroacetamide (BSTFA). לאחר מכן, התמציות המפורקות נמדדות באמצעות מערכת כרומטוגרף גז יחד עם ספקטרומטר מסה בזמן טיסה (GC-TOF-MS). נתוני המטבוליטים שנרכשו מנותחים לאחר מכן על בסיס שיטות ביואינפורמטיקה. מטבוליטים דיפרנציאליים ומסלולי חילוף חומרים שהשתנו באופן משמעותי צריכים להיחקר לעומק כדי לחשוף את ההשפעה של DEHP על אספסת לאור הפרשות שורש.
Introduction
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) הוא תרכובת כימית סינתטית הנמצאת בשימוש נרחב פלסטיק ופולימרים שונים כמו plasticizer כדי לשפר את הפלסטיות שלהם ואת החוזק. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מחקרים הציעו כי DEHP הוא משבש אנדוקריני ויש לו השפעה שלילית על מערכות הנשימה, העצבים והרבייה של בני אדם ובעלי חיים אחרים 1,2,3. בהתחשב בסיכון הבריאותי שלה, הסוכנות להגנת הסביבה של ארצות הברית, האיחוד האירופי ומרכז ניטור הסביבה של סין סיווגו כולם DEHP ברשימת המזהמים העדיפים. הקרקע נחשבת לכיור חשוב של DEHP בסביבה, בשל יישום חיפוי פלסטיק ודשנים אורגניים, השקיה במי קולחין ויישום חוות בוצה4. כצפוי, DEHP זוהה בכל מקום בקרקעות חקלאיות, שתכולתן מגיעה אפילו עד מיליגרם לקילוגרם של אדמה יבשה באזורים מסוימים בסין 5,6. DEHP יכול להיכנס לצמחים בעיקר דרך השורשים ולעבור הגדלה ביולוגית ברמות טרופיות שונות במערכות אקולוגיות בקרקע7. לכן, הועלה חשש משמעותי לגבי עקה הנגרמת על ידי DEHP בצמחים במהלך העשורים האחרונים.
צמחים בדרך כלל פגיעים לחשיפה ל- DEHP. לחץ DEHP נצפה כגורם להשפעה שלילית על נביטת זרעים ומטבוליזם תקין, ובכך מעכב צמיחה והתפתחות של צמחים 8,9. לדוגמה, DEHP יכול לגרום נזק חמצוני לתאי מזופיל, להפחית את תכולת הכלורופיל והאוסמוליטים, ולהגביר את פעילות האנזימים נוגדי החמצון, מה שבסופו של דבר גורם לירידה ביבול ובאיכות של צמחי מאכל10,11. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים על תגובת צמחים לעקה DEHP התמקדו בעקה חמצונית ובמאפיינים פיזיולוגיים וביוכימיים. המנגנונים המתאימים הקשורים למטבוליזם של צמחים נחקרים פחות. הפרשת שורשים היא מונח גנרי המתאר תרכובות ששורשי הצמח מפרישים ומשחררים לסביבה. הם נחשבו כאמצעי האינטראקציה בין צמחים לאדמת ריזוספרה, וממלאים תפקיד חשוב בתמיכה בצמיחה ובהתפתחות של צמחים12. ידוע כי הפרשות שורשים מהוות כ-30%-40% מכלל הפחמן הפוטוסינתטי13. בסביבות מזוהמות, הפרשות שורשים מעורבות בשיפור הסבילות של צמחים לעקה של מזהמים באמצעות חילוף חומרים או הרחקה חיצונית14. כתוצאה מכך, הבנה מעמיקה של תגובת שורשי הצמח להעקה של זיהום עשויה לסייע בחשיפת המנגנונים הבסיסיים הקשורים לביוכימיה של התא ולתופעות ביולוגיות15.
טכנולוגיית מטבולומיקה מספקת אסטרטגיה יעילה למדידת מספר רב של מטבוליטים של מולקולות קטנות בו זמנית בתוך תאים 16,17, רקמות18, ואפילו הפרשה של אורגניזמים 19, כולל סוכרים, חומצות אורגניות, חומצות אמינו ושומנים. בהשוואה לשיטות ניתוח כימיות מסורתיות או קלאסיות, גישת המטבולומיקה מגדילה מאוד את מספר המטבוליטים שניתן לזהות20, מה שיכול לסייע בזיהוי מטבוליטים בדרך תפוקה גבוהה יותר ובזיהוי מסלולים מטבוליים מרכזיים. מטבולומיקה נמצאת בשימוש נרחב בתחום המחקר של תגובה ביולוגית בסביבות עקה, כגון מתכות כבדות21, מזהמים מתפתחים22 וננו-חלקיקים19. רוב המחקרים הללו על צמחים התמקדו בשינויים המטבוליים ברקמות הפנים של הצמח, בעוד שמעטים דווחו על התגובה של הפרשת שורשים לעקה סביבתית. לכן, מטרת מחקר זה היא להציג הנחיות כלליות לאיסוף הפרשות שורש אספסת כדי לחקור את ההשפעה של DEHP על ייצור מטבוליטים. התוצאות יספקו הנחיית שיטה למחקר המשך של מטבולומיקה של צמחים על ידי DEHP.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק הדרכה כללית כיצד לאסוף ולמדוד את הפרשות השורש של אספסת תחת לחץ DEHP, כמו גם כיצד לנתח את נתוני חילוף החומרים. יש להקדיש תשומת לב רבה לכמה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. בניסויים בתרבית הידרופונית, שתילי אספסת תורבתו הידרופונית בבקבוקי זכוכית מלאים בתמיסות מזון עם ריכוזים שונים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה במשותף על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (41877139), הפרויקטים העיקריים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (41991335), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2016YFD0800204), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג’יאנגסו (מס ‘BK20161616), תוכנית “135” ותוכנית הגבולות של האקדמיה הסינית למדעים (ISSASIP1615).
Materials
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
References
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
- van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
- Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
- Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
- Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
- Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
- Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
- Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
- Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
- Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
- Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
- Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
- vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
- Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
- Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
- Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
- Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
- Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
- Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
- Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
- Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
- Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
- Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
- van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
- Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
- Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
- Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , 319-321 (2003).
- Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
- Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
- Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
- Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
- Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).
