Innsamling av alfalfarot ekssudater for å studere virkningen av di (2-etylheksyl) ftalat på metabolittproduksjon

Summary

Sekresjonen av rotekssudater er vanligvis en ekstern avgiftningsstrategi for planter under stressforhold. Denne protokollen beskriver hvordan man vurderer virkningen av xenobiotika på alfalfa via ikke-målrettet metabolomisk analyse.

Abstract

Rotekssudater er hovedmediet for informasjonskommunikasjon og energioverføring mellom planterøtter og omgivelsene. Endringen i sekresjon av rotekssudater er vanligvis en ekstern avgiftningsstrategi for planter under stressforhold. Denne protokollen tar sikte på å introdusere generelle retningslinjer for innsamling av alfalfarotekssudater for å studere virkningen av di (2-etylheksyl) ftalat (DEHP) på metabolittproduksjon. For det første dyrkes alfalfaplanter under DEHP-stress i et hydroponisk kultureksperiment. For det andre overføres plantene til sentrifugerør som inneholder 50 ml sterilisert ultrarent vann i 6 timer for å samle rotekssudater. Løsningene frysetørkes deretter i en vakuumfrysetørker. De frosne prøvene ekstraheres og derivatiseres med bis(trimetylsilyl)) trifluoracetamid (BSTFA) reagens. Deretter måles de derivatiserte ekstraktene ved hjelp av et gasskromatografsystem kombinert med et time-of-flight massespektrometer (GC-TOF-MS). De ervervede metabolittdataene analyseres deretter basert på bioinformatiske metoder. Differensialmetabolitter og signifikant endrede metabolismeveier bør undersøkes dypt for å avsløre virkningen av DEHP på alfalfa i lys av rotekssudater.

Introduction

Di (2-etylheksyl) ftalat (DEHP) er en syntetisk kjemisk forbindelse som er mye brukt i forskjellige plast og polymerer som mykner for å forbedre plastisiteten og styrken. I løpet av de siste årene har et økende antall studier antydet at DEHP er hormonforstyrrende og har negativ effekt på respiratoriske, nervøse og reproduktive systemer hos mennesker og andre dyr ^1,2,3. Med tanke på helserisikoen har USAs miljøvernbyrå, EU og Environmental Monitoring Center of China alle klassifisert DEHP i listen over prioriterte forurensende stoffer. Jord har blitt ansett som en viktig vask av DEHP i miljøet, på grunn av påføring av plastmulching og organisk gjødsel, vanning med avløpsvann og slambruk⁴. Som forventet har DEHP blitt allestedsnærværende oppdaget i jordbruksjord, hvis innhold til og med når opp til milligram per kilo tørket jord i noen regioner i Kina ^5,6. DEHP kan gå inn i planter hovedsakelig via røttene og gjennomgå biomagnifisering på forskjellige trofiske nivåer i jordøkosystemer⁷. Derfor har det blitt reist betydelig bekymring for DEHP-indusert stress i planter de siste tiårene.

Planter er vanligvis sårbare for DEHP-eksponering. DEHP-stress har blitt observert å utøve en negativ effekt på frøspredning og normal metabolisme, og dermed hemme plantevekst og utvikling ^8,9. For eksempel kan DEHP indusere oksidativ skade på mesofyllceller, redusere innholdet av klorofyll og osmolytter, og heve antioksidative enzymaktiviteter, noe som til slutt resulterer i en nedgang i utbyttet og kvaliteten på spiselige planter^10,11. Imidlertid har de fleste av de tidligere studiene på planters respons på DEHP-stress fokusert på oksidativt stress og fysiologiske og biokjemiske egenskaper. De tilsvarende mekanismene forbundet med plantemetabolisme er mindre studert. Rotekssudater er et generisk begrep som beskriver forbindelser som planterøtter skiller ut og slipper ut i miljøet. De har blitt betraktet som interaksjonsmediet mellom planter og jord i rhizosfæren, og spiller en viktig rolle i å støtte plantevekst og utvikling¹². Det har vært velkjent at rotekssudater står for omtrent 30% -40% av alt fotosyntetisk karbon¹³. I forurensede miljøer er rotekssudater involvert i å forbedre plantens toleranse for stress av forurensende stoffer gjennom metabolisme eller ekstern ekskludering¹⁴. Som en konsekvens kan en dyp forståelse av responsen av planterot ekssudater til forurensningsstress bidra til å avsløre de underliggende mekanismene forbundet med cellebiokjemi og biologiske fenomener¹⁵.

Metabolomics-teknologi gir en effektiv strategi for å måle et stort antall småmolekylære metabolitter samtidig i celler 16,17, vev¹⁸, og til og med ekssudater av organismer ¹⁹, inkludert sukkerarter, organiske syrer, aminosyrer og lipider. Sammenlignet med tradisjonelle eller klassiske kjemiske analysemetoder, øker metabolomics-tilnærmingen i stor grad antall metabolitter som kan detekteres²⁰, noe som kan bidra til å identifisere metabolitter på en høyere gjennomstrømningsmåte og identifisere viktige metabolske veier. Metabolomics har vært mye brukt i forskningsfeltet biologisk respons i stresmiljøer, som tungmetaller²¹, nye forurensninger²² og nanopartikler¹⁹. De fleste av disse studiene på planter har fokusert på metabolske endringer i indre plantevev, mens få har blitt rapportert om responsen av rotekssudater til miljøstress. Derfor er målet med denne studien å introdusere generelle retningslinjer for innsamling av alfalfarotekssudater for å studere virkningen av DEHP på metabolittproduksjon. Resultatene vil gi en metodeveiledning for DEHPs oppfølgingsstudie av plantemetabolomikk.

Protocol

Målet med denne protokollen er å gi en generell rørledning, fra et hydroponisk kultureksperiment til metabolomisk analyse, kvantifisere effekten av DEHP på alfalfarotekssudater. 1. Hydroponisk kultureksperiment MERK: Denne protokollen presenterer et eksempel på et alfalfa hydroponisk kultureksperiment designet for å oppnå alfalfa (Medicago sativa) frøplanter under stress av forskjellige konsentrasjoner av DEHP. Tre behandlinger ble sa…

Representative Results

I dette eksperimentet ble alfalfarotekssudater samlet, ekstrahert og analysert i henhold til metodene ovenfor (figur 1). Tre behandlingsgrupper ble satt opp: kontroll, lav konsentrasjon av DEHP (1 mg L-1) og høy konsentrasjon av DEHP (10 mg L-1). Totalt 778 topper ble detektert i kromatografen til kontrollgruppen, hvorav 314 metabolitter kunne identifiseres i henhold til massespektrene. Som vist i figur 2, kan d…

Discussion

Denne protokollen gir generell veiledning om hvordan man samler inn og måler rotekssudatene av alfalfa under DEHP-stress, samt hvordan man analyserer metabolomdataene. Det må legges stor vekt på noen kritiske trinn i denne protokollen. I hydroponiske kultureksperimenter ble alfalfaplanter hydroponisk dyrket i glassflasker fylt med næringsoppløsninger med forskjellige konsentrasjoner av DEHP. Glassflaskene skal beskyttes mot lys ved å dekke dem med aluminiumsfolie gjennom hele kulturperioden, for å forhindre DEHP f…

Materials

Adonitol	SIGMA		≥99%
Alfalfa seeds	Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance	Sartorius	BSA124S-CW
BSTFA	REGIS Technologies		with 1% TMCS, v/v
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Fresco17
Chromatographic column	Agilent	DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate	Dr. Ehrenstorfer
FAMEs	Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC)	Agilent	7890A
Grinding instrument	Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd	JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS)	LECO	PEGASUS HT
Methanol	CNW Technologies		HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride	TCI		AR
Microcentrifuge tube	Eppendorf	Eppendorf Quality	1.5 mL
Oven	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd	DHG-9023A
Pyridine	Adamas		HPLC
R software			statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2			statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer	Thermo Fisher Scientific	Forma 900 series
Ultrasound	Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd	YM-080S
Vacuum dryer	Taicang Huamei biochemical instrument factory	LNG-T98