JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Insamling av alfalfa rot exsudat för att studera effekten av di (2-etylhexyl) ftalat på metabolitproduktion

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64470
, , ,
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment,University of Chinese Academy of Sciences

Summary

Utsöndringen av rotutsöndringar är vanligtvis en extern avgiftningsstrategi för växter under stressförhållanden. Detta protokoll beskriver hur man bedömer effekterna av xenobiotika på alfalfa via icke-riktad metabolomisk analys.

Abstract

Rotutsöndringar är det viktigaste mediet för informationskommunikation och energiöverföring mellan växtrötter och den omgivande miljön. Förändringen i utsöndring av rotutsöndringar är vanligtvis en extern avgiftningsstrategi för växter under stressförhållanden. Detta protokoll syftar till att införa allmänna riktlinjer för insamling av alfalfarotexadat för att studera effekterna av di (2-etylhexyl) ftalat (DEHP) på metabolitproduktionen. Först odlas alfalfa plantor under DEHP-stress i ett hydroponiskt odlingsexperiment. För det andra överförs växterna till centrifugrör innehållande 50 ml steriliserat ultrarent vatten i 6 timmar för att samla rotutsöndringar. Lösningarna frystorkas sedan i en vakuumfrystork. De frysta proverna extraheras och derivatiseras med bis(trimetylsilyl)) trifluororacetamid (BSTFA)-reagens. Därefter mäts de derivatiserade extrakten med användning av ett gaskromatografsystem kopplat till en masspektrometer (GC-TOF-MS). De förvärvade metabolitdata analyseras sedan baserat på bioinformatiska metoder. Differentiella metaboliter och signifikant förändrade metabolismvägar bör undersökas djupt för att avslöja effekten av DEHP på alfalfa med tanke på rotutsöndringar.

Introduction

Di (2-etylhexyl) ftalat (DEHP) är en syntetisk kemisk förening som ofta används i olika plaster och polymerer som mjukgörare för att förbättra deras plasticitet och styrka. Under de senaste åren har ett ökande antal studier föreslagit att DEHP är ett hormonstörande ämne och har negativa effekter på andnings-, nerv- och reproduktionssystemen hos människor och andra djur 1,2,3. Med tanke på dess hälsorisk har USA: s miljöskyddsbyrå, Europeiska unionen och Environmental Monitoring Center of China alla klassificerat DEHP i listan över prioriterade föroreningar. Jord har ansetts vara en viktig sänka för DEHP i miljön på grund av applicering av plastmassning och organiska gödningsmedel, bevattning med avloppsvatten och applicering av slamgård4. Som förväntat har DEHP upptäckts överallt i jordbruksmark, vars innehåll till och med når upp till milligram per kilo torkad jord i vissa regioner i Kina 5,6. DEHP kan komma in i växter huvudsakligen via rötterna och genomgå biomagnifiering på olika trofiska nivåer i markekosystem7. Därför har betydande oro väckts om DEHP-inducerad stress i växter under de senaste decennierna.

Växter är vanligtvis sårbara för DEHP-exponering. DEHP-stress har observerats utöva en negativ effekt på frögroning och normal metabolism, vilket hämmar växttillväxt och utveckling 8,9. Till exempel kan DEHP inducera oxidativ skada på mesofyllceller, minska innehållet i klorofyll och osmolyter och höja antioxidativa enzymaktiviteter, vilket så småningom resulterar i en minskning av utbytet och kvaliteten på ätbara växter10,11. De flesta av de tidigare studierna om växternas svar på DEHP-stress har dock fokuserat på oxidativ stress och fysiologiska och biokemiska egenskaper. Motsvarande mekanismer associerade med växtmetabolism är mindre studerade. Rotutsöndringar är en generisk term som beskriver föreningar som växtrötter utsöndrar och släpper ut i miljön. De har betraktats som interaktionsmedia mellan växter och rhizosfärjord och spelar en viktig roll för att stödja växttillväxt och utveckling12. Det har varit välkänt att rotutsöndringar står för cirka 30% -40% av allt fotosyntetiskt kol13. I förorenade miljöer är rotutsöndringar involverade i att förbättra växternas tolerans mot föroreningarnas stress genom metabolism eller extern uteslutning14. Som en konsekvens kan en djup förståelse av svaret från växtrotutsöndringar på föroreningsstress hjälpa till att avslöja de underliggande mekanismerna i samband med cellbiokemi och biologiska fenomen15.

Metabolomikteknik ger en effektiv strategi för att mäta ett stort antal småmolekylära metaboliter samtidigt i cellerna 16,17, vävnader18 och till och med utsöndringar av organismer 19, inklusive sockerarter, organiska syror, aminosyror och lipider. Jämfört med traditionella eller klassiska kemiska analysmetoder ökar metabolomikmetoden kraftigt antalet metaboliter som kan detekteras20, vilket kan hjälpa till att identifiera metaboliter på ett högre genomströmningssätt och identifiera viktiga metaboliska vägar. Metabolomik har använts i stor utsträckning inom forskningsområdet biologisk respons i stressmiljöer, såsom tungmetaller21, nya föroreningar22 och nanopartiklar19. De flesta av dessa studier på växter har fokuserat på de metaboliska förändringarna i inre växtvävnader, medan få har rapporterats om rotutsöndringarnas svar på miljöstress. Därför är syftet med denna studie att införa allmänna riktlinjer för insamling av alfalfa rotutsöndringar för att studera effekterna av DEHP på metabolitproduktionen. Resultaten kommer att ge en metodvägledning för uppföljningsstudien av växtmetabolomik med DEHP.

Protocol

Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en allmän pipeline, från ett hydroponiskt odlingsexperiment till metabolomisk analys, kvantifiera effekten av DEHP på alfalfarotutsöndringar. 1. Hydroponiskt odlingsexperiment OBS: Detta protokoll presenterar ett exempel på ett alfalfa hydroponiskt odlingsexperiment utformat för att erhålla alfalfa (Medicago sativa) plantor under stress av olika koncentrationer av DEHP. Tre behandlinga…

Representative Results

I detta experiment samlades alfalfa rotutsöndringar, extraherades och analyserades enligt ovanstående metoder (figur 1). Tre behandlingsgrupper inrättades: kontroll, låg koncentration av DEHP (1 mg L−1) och hög koncentration av DEHP (10 mg L−1). Totalt 778 toppar detekterades i kontrollens kromatograf, varav 314 metaboliter kunde identifieras enligt masspektra. Som visas i figur 2 kan dessa metaboliter k…

Discussion

Detta protokoll ger allmän vägledning om hur man samlar in och mäter rotutsöndringarna av alfalfa under DEHP-stress, samt hur man analyserar metabolomdata. Noggrann uppmärksamhet måste ägnas åt några kritiska steg i detta protokoll. I hydroponiska odlingsexperiment odlades alfalfa plantor hydroponiskt i glasflaskor fyllda med näringslösningar med olika koncentrationer av DEHP. Glasflaskorna bör skyddas mot ljus genom att täcka dem med aluminiumfolie under hela odlingsperioden för att förhindra DEHP från f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes gemensamt av National Natural Science Foundation of China (41877139), de stora projekten från National Natural Science Foundation of China (41991335), Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2016YFD0800204), Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (nr BK20161616), “135” -planen och Frontiers-programmet för den kinesiska vetenskapsakademin (ISSASIP1615).

Materials

Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
  2. Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
  3. van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
  4. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  5. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  6. Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
  7. Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
  8. Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
  9. Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
  10. Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
  11. Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
  12. Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
  13. Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
  14. Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
  15. Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
  16. Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
  17. vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
  18. Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
  19. Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
  20. Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
  21. Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
  22. Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
  23. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  24. Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  25. Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
  26. Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
  27. Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
  28. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  29. Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
  30. Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
  31. Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
  32. Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
  33. van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
  34. Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
  35. Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
  36. Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , 319-321 (2003).
  37. Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
  38. Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
  39. Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
  40. Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
  41. Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
  42. Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
  43. Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).

Tags

AlfalfaRoot ExudatesDi(2-ethylhexyl) PhthalateDEHPXenobioticsMetabolomicsMedicago SativaSeed SterilizationGerminationRoot Exudate CollectionMetabolite ProfilingExtractionCentrifugation
check_url/64470?article_type=t&slug=collection-alfalfa-root-exudates-to-study-impact-di2-ethylhexyl

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image