Utsöndringen av rotutsöndringar är vanligtvis en extern avgiftningsstrategi för växter under stressförhållanden. Detta protokoll beskriver hur man bedömer effekterna av xenobiotika på alfalfa via icke-riktad metabolomisk analys.
Rotutsöndringar är det viktigaste mediet för informationskommunikation och energiöverföring mellan växtrötter och den omgivande miljön. Förändringen i utsöndring av rotutsöndringar är vanligtvis en extern avgiftningsstrategi för växter under stressförhållanden. Detta protokoll syftar till att införa allmänna riktlinjer för insamling av alfalfarotexadat för att studera effekterna av di (2-etylhexyl) ftalat (DEHP) på metabolitproduktionen. Först odlas alfalfa plantor under DEHP-stress i ett hydroponiskt odlingsexperiment. För det andra överförs växterna till centrifugrör innehållande 50 ml steriliserat ultrarent vatten i 6 timmar för att samla rotutsöndringar. Lösningarna frystorkas sedan i en vakuumfrystork. De frysta proverna extraheras och derivatiseras med bis(trimetylsilyl)) trifluororacetamid (BSTFA)-reagens. Därefter mäts de derivatiserade extrakten med användning av ett gaskromatografsystem kopplat till en masspektrometer (GC-TOF-MS). De förvärvade metabolitdata analyseras sedan baserat på bioinformatiska metoder. Differentiella metaboliter och signifikant förändrade metabolismvägar bör undersökas djupt för att avslöja effekten av DEHP på alfalfa med tanke på rotutsöndringar.
Di (2-etylhexyl) ftalat (DEHP) är en syntetisk kemisk förening som ofta används i olika plaster och polymerer som mjukgörare för att förbättra deras plasticitet och styrka. Under de senaste åren har ett ökande antal studier föreslagit att DEHP är ett hormonstörande ämne och har negativa effekter på andnings-, nerv- och reproduktionssystemen hos människor och andra djur 1,2,3. Med tanke på dess hälsorisk har USA: s miljöskyddsbyrå, Europeiska unionen och Environmental Monitoring Center of China alla klassificerat DEHP i listan över prioriterade föroreningar. Jord har ansetts vara en viktig sänka för DEHP i miljön på grund av applicering av plastmassning och organiska gödningsmedel, bevattning med avloppsvatten och applicering av slamgård4. Som förväntat har DEHP upptäckts överallt i jordbruksmark, vars innehåll till och med når upp till milligram per kilo torkad jord i vissa regioner i Kina 5,6. DEHP kan komma in i växter huvudsakligen via rötterna och genomgå biomagnifiering på olika trofiska nivåer i markekosystem7. Därför har betydande oro väckts om DEHP-inducerad stress i växter under de senaste decennierna.
Växter är vanligtvis sårbara för DEHP-exponering. DEHP-stress har observerats utöva en negativ effekt på frögroning och normal metabolism, vilket hämmar växttillväxt och utveckling 8,9. Till exempel kan DEHP inducera oxidativ skada på mesofyllceller, minska innehållet i klorofyll och osmolyter och höja antioxidativa enzymaktiviteter, vilket så småningom resulterar i en minskning av utbytet och kvaliteten på ätbara växter10,11. De flesta av de tidigare studierna om växternas svar på DEHP-stress har dock fokuserat på oxidativ stress och fysiologiska och biokemiska egenskaper. Motsvarande mekanismer associerade med växtmetabolism är mindre studerade. Rotutsöndringar är en generisk term som beskriver föreningar som växtrötter utsöndrar och släpper ut i miljön. De har betraktats som interaktionsmedia mellan växter och rhizosfärjord och spelar en viktig roll för att stödja växttillväxt och utveckling12. Det har varit välkänt att rotutsöndringar står för cirka 30% -40% av allt fotosyntetiskt kol13. I förorenade miljöer är rotutsöndringar involverade i att förbättra växternas tolerans mot föroreningarnas stress genom metabolism eller extern uteslutning14. Som en konsekvens kan en djup förståelse av svaret från växtrotutsöndringar på föroreningsstress hjälpa till att avslöja de underliggande mekanismerna i samband med cellbiokemi och biologiska fenomen15.
Metabolomikteknik ger en effektiv strategi för att mäta ett stort antal småmolekylära metaboliter samtidigt i cellerna 16,17, vävnader18 och till och med utsöndringar av organismer 19, inklusive sockerarter, organiska syror, aminosyror och lipider. Jämfört med traditionella eller klassiska kemiska analysmetoder ökar metabolomikmetoden kraftigt antalet metaboliter som kan detekteras20, vilket kan hjälpa till att identifiera metaboliter på ett högre genomströmningssätt och identifiera viktiga metaboliska vägar. Metabolomik har använts i stor utsträckning inom forskningsområdet biologisk respons i stressmiljöer, såsom tungmetaller21, nya föroreningar22 och nanopartiklar19. De flesta av dessa studier på växter har fokuserat på de metaboliska förändringarna i inre växtvävnader, medan få har rapporterats om rotutsöndringarnas svar på miljöstress. Därför är syftet med denna studie att införa allmänna riktlinjer för insamling av alfalfa rotutsöndringar för att studera effekterna av DEHP på metabolitproduktionen. Resultaten kommer att ge en metodvägledning för uppföljningsstudien av växtmetabolomik med DEHP.
Detta protokoll ger allmän vägledning om hur man samlar in och mäter rotutsöndringarna av alfalfa under DEHP-stress, samt hur man analyserar metabolomdata. Noggrann uppmärksamhet måste ägnas åt några kritiska steg i detta protokoll. I hydroponiska odlingsexperiment odlades alfalfa plantor hydroponiskt i glasflaskor fyllda med näringslösningar med olika koncentrationer av DEHP. Glasflaskorna bör skyddas mot ljus genom att täcka dem med aluminiumfolie under hela odlingsperioden för att förhindra DEHP från f…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes gemensamt av National Natural Science Foundation of China (41877139), de stora projekten från National Natural Science Foundation of China (41991335), Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2016YFD0800204), Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (nr BK20161616), “135” -planen och Frontiers-programmet för den kinesiska vetenskapsakademin (ISSASIP1615).
Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
Pyridine | Adamas | HPLC | |
R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |