Denne protokol beskriver en effektiv metode til at differentiere hiPSC’er i øjenfeltklynger og generere neuro-retinale organoider ved hjælp af forenklede dyrkningsbetingelser, der involverer både vedhængende og suspensionskultursystemer. Andre okulære celletyper, såsom RPE og hornhindepitel, kan også isoleres fra modne øjenfelter i retinale kulturer.
Pluripotente stamceller kan generere komplekse vævsorganoider, der er nyttige til in vitro sygdomsmodelleringsundersøgelser og til udvikling af regenerative terapier. Denne protokol beskriver en enklere, robust og trinvis metode til generering af retinale organoider i et hybridkultursystem bestående af klæbende enkeltlagskulturer i løbet af de første 4 uger af retinal differentiering indtil fremkomsten af forskellige, selvorganiserede øjenfeltprimordiale klynger (EFP’er). Endvidere plukkes de doughnutformede, cirkulære og gennemskinnelige neuro-retinale øer inden for hver EFP manuelt og dyrkes under suspension ved hjælp af ikke-klæbende kulturskåle i et retinalt differentieringsmedium i 1-2 uger for at generere flerlags 3D-optiske kopper (OC-1M). Disse umodne retinale organoider indeholder PAX6+ og ChX10+ proliferationerende, multipotente retinale forløbere. Forløbercellerne er lineært selvsamlede inden for organoiderne og fremstår som forskellige radiale striber. Ved 4 uger efter suspensionskultur gennemgår retinale forfædre postmitotisk anholdelse og afstamningsdifferentiering for at danne modne retinale organoider (OC-2M). Fotoreceptorafstamningen begik forstadier udvikler sig inden for de yderste lag af retinale organoider. Disse CRX+ og RCVRN+ fotoreceptorceller modnes morfologisk til at vise indre segmentlignende udvidelser. Denne metode kan anvendes til generering af retinale organoider ved hjælp af humane embryonale stamceller (hESC’er) og inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er). Alle trin og procedurer er tydeligt forklaret og demonstreret for at sikre replikabilitet og til bredere anvendelser inden for grundvidenskab og translationel forskning.
Nethinden er et lysfølsomt væv til stede bag på hvirveldyrets øje, der omdanner lyssignaler til nerveimpulser ved et biokemisk fænomen kendt som fototransduktionsvejen. De indledende nerveimpulser, der genereres i nethindens fotoreceptorceller, transduceres til andre retinale interneuroner og retinale ganglionceller (RGC’er) og når hjernens visuelle cortex, hvilket hjælper med billedopfattelse og visuel respons.
Ifølge Verdenssundhedsorganisationen (WHO) er anslået 1,5 millioner børn blinde, hvoraf 1 million er i Asien. Arvelig retinal dystrofi (IRD) er en alvorlig blindende sygdom, der rammer 1 ud af 4.000 individer over hele verden 1,2,3, mens forekomsten af blindhed forbundet med aldersrelateret makuladegeneration (AMD) varierer fra 0,6% –1,1% i udviklingslande 4. IRD’er er forårsaget af arvelige genetiske defekter i over 300 forskellige gener, der er involveret i retinal udvikling og funktion5. Sådanne genetiske ændringer resulterer i forstyrrelse af normale retinale funktioner og gradvis degeneration af retinale celler, nemlig fotoreceptorcellerne og det retinale pigmenterede epitel (RPE), hvilket fører til alvorligt synstab og blindhed. Der er gjort enorme fremskridt under andre blændende forhold, der involverer hornhinden, linsen osv. Imidlertid har retinale dystrofier og optiske nerveatrofier ikke nogen dokumenteret terapi til dato. Da en voksen menneskelig nethinde ikke har stamceller6, kan alternative kilder såsom embryonale stamceller (ESC’er) og patientafledte inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) give et ubegrænset udbud af ønskede celletyper og have et stort løfte om udvikling af komplekse vævsorganoider, der kræves til in vitro-sygdomsmodelleringsundersøgelser og til udvikling af regenerative terapier7, 8,9,10.
Flere års retinal forskning har ført til en bedre forståelse af molekylære begivenheder, der orkestrerer tidlig retinal udvikling. De fleste protokoller til generering af retinale celler og 3D-organoider fra PSC’er sigter mod at rekapitulere disse udviklingsbegivenheder in vitro ved at dyrke cellerne i en kompleks cocktail af vækstfaktorer og små molekyler for at modulere de kendte biologiske processer trinvist. De retinale organoider, der således genereres, består af store retinale celler: retinale ganglionceller (RGC’er), interneuroner, fotoreceptorer og retinal pigmenteret epitel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. På trods af vellykkede forsøg på at modellere IRD’er ved hjælp af retinale organoider udgør kravet om den komplekse cocktail af vækstfaktorer og små molekyler under differentiering og den relativt lave effektivitet af retinal organoidgenerering en stor udfordring med de fleste protokoller. De omfatter hovedsageligt dannelsen af embryoidlegemer efterfulgt af deres trinvise differentiering i retinale slægter ved hjælp af komplekse kulturbetingelser på forskellige stadier af in vitro-udvikling 20,21,22.
Her rapporteres en forenklet og robust metode til udvikling af komplekse 3D neuro-retinale organoider fra sund kontrol og retinale sygdomsspecifikke hiPSC’er. Protokollen beskrevet her anvender direkte differentiering af nær-sammenflydende hiPSC-kulturer uden behov for embryoid kropsdannelse. Kompleksiteten af kulturmediet er også forenklet, hvilket gør det til en omkostningseffektiv og reproducerbar teknik, der let kan vedtages af nye forskere. Det involverer et hybridkultursystem bestående af vedhængende enkeltlagskulturer i løbet af de første 4 uger af retinal differentiering indtil fremkomsten af forskellige, selvorganiserede øjenfeltprimordialklynger (EFP’er). Endvidere plukkes de cirkulære neuro-retinale øer inden for hver EFP manuelt og dyrkes i suspensionskulturer i 1-2 uger for at forberede flerlags 3D retinale kopper eller organoider bestående af PAX6 + og CHX10 + prolifererende neuro-retinale forløbere. Udvidet dyrkning af retinale organoider i 100 μM taurinholdigt medium i yderligere 4 uger resulterede i fremkomsten af RCVRN + og CRX+ fotoreceptorprækursorer og modne celler med rudimentære indre segmentlignende forlængelser.
hiPSC’er er et kraftfuldt værktøj til at studere organ- og vævsudvikling in vitro. Rekapitulering af sygdomsfænotypen ved at differentiere sunde versus sygdomsspecifikke hiPSC’er mod retinal afstamning kan hjælpe med at få nyere indsigt i patofysiologien af forskellige former for arvelige retinale dystrofier. Flere protokoller er blevet beskrevet og vedtaget til in vitro-differentiering af PSC’er i retinale celletyper. De fleste af dem involverer brugen af kulturmedium, der indeholder komplekse co…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender den videnskabelige og tekniske støtte fra Dr. Chitra Kannabiran, genetiker; Dr. Subhadra Jalali, retinal konsulent; Dr. Milind Naik, oculoplastikkirurg; og Dr. Swathi Kaliki, okulær onkolog ved LV Prasad Eye Institute, Hyderabad mod generering af normale og patientspecifikke iPSC-linjer. Forfatterne anerkender F & U-tilskud fra Science and Engineering Research Board, Institut for Videnskab og Teknologi (IM), (SB / SO / HS / 177/2013), Institut for Bioteknologi (IM) (BT / PR32404 / MED / 30/2136/2019) og seniorforskningsstipendier fra ICMR (S.M., D.P.), UGC (TA) og CSIR (V.K.P.), Indiens regering.
0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |