Ipertermia generata da ultrasuoni focalizzati ad alta intensità guidata da risonanza magnetica: un metodo di trattamento fattibile in un modello di rabdomiosarcoma murino

Summary

Presentato qui è un protocollo per utilizzare l’ipertermia controllata, generata da ultrasuoni focalizzati ad alta intensità guidati da risonanza magnetica, per innescare il rilascio di farmaci da liposomi sensibili alla temperatura in un modello murino di rabdomiosarcoma.

Abstract

L’ultrasuono focalizzato ad alta intensità guidato da risonanza magnetica (MRgHIFU) è un metodo consolidato per produrre ipertermia localizzata. Data l’imaging in tempo reale e la modulazione dell’energia acustica, questa modalità consente un controllo preciso della temperatura all’interno di un’area definita. Molte applicazioni termiche vengono esplorate con questa tecnologia non invasiva e non ionizzante, come la generazione di ipertermia, per rilasciare farmaci da vettori liposomiali termosensibili. Questi farmaci possono includere chemioterapie come la doxorubicina, per la quale è auspicabile un rilascio mirato a causa degli effetti collaterali sistemici dose-limitanti, vale a dire la cardiotossicità. La doxorubicina è un pilastro per il trattamento di una varietà di tumori maligni ed è comunemente usata nel rabdomiosarcoma recidivante o ricorrente (RMS). RMS è il tumore extracranico dei tessuti molli solidi più comune nei bambini e nei giovani adulti. Nonostante la terapia aggressiva e multimodale, i tassi di sopravvivenza della RMS sono rimasti gli stessi negli ultimi 30 anni. Per esplorare una soluzione per affrontare questo bisogno insoddisfatto, è stato sviluppato un protocollo sperimentale per valutare il rilascio di doxorubicina liposomiale termosensibile (TLD) in un modello murino RMS immunocompetente e singeneico utilizzando MRgHIFU come fonte di ipertermia per il rilascio del farmaco.

Introduction

Il rabdomiosarcoma (RMS) è un tumore del muscolo scheletrico che si verifica più comunemente nei bambini e nei giovani adulti¹. La malattia localizzata è spesso trattata con un trattamento multimodale, tra cui chemioterapia, radiazioni ionizzanti e chirurgia. L’uso di regimi chemioterapici multi-farmaco è più diffuso nei pazienti pediatrici, con risultati migliori rispetto alle loro controparti adulte²; Tuttavia, nonostante gli sforzi di ricerca in corso, il tasso di sopravvivenza a 5 anni rimane intorno al 30% nella forma più aggressiva della malattia ^3,4. Lo standard di cura della chemioterapia è un regime multifarmaco che include vincristina, ciclofosfamide e actinomicina D. In caso di malattia recidivante o ricorrente, vengono utilizzate chemioterapie alternative, tra cui doxorubicina (FD) standard (libera) e ifosfamide¹. Mentre tutte queste chemioterapie hanno tossicità sistemiche, la cardiotossicità della doxorubicina impone una limitazione della dose per tutta la vita ^5-7. Per aumentare la quantità del farmaco somministrato al tumore e ridurre al minimo la tossicità sistemica, sono state sviluppate formulazioni alternative, incluso l’incapsulamento liposomiale. Questi possono essere doxorubicina non termosensibile, che è stata approvata per il trattamento del cancro al seno e del carcinoma epatocellulare, o doxorubicina termosensibile, per la quale sono in corso studi clinici 8,9,10,11,12,13. Sono stati valutati metodi alternativi per la somministrazione di farmaci incapsulati liposomiali come liposomi multi-vescicolari e liposomi mirati al ligando e mostrano risultati promettenti per il trattamento dei tumori⁹. In questo studio, l’aggiunta di calore ha impatti multifattoriali, incluso il rilascio di farmaci¹⁴. La combinazione di ipertermia (HT) generata con ultrasuoni focalizzati ad alta intensità guidati da risonanza magnetica (MRgHIFU) e doxorubicina liposomiale termosensibile (TLD) è un nuovo approccio terapeutico multimodale per l’utilizzo di questo farmaco tossico ma efficace per il trattamento della RMS, riducendo al minimo la tossicità dose-limitante e aumentando potenzialmente la risposta immunitaria al tumore.

La doxorubicina si rilascia rapidamente dal TLD a temperature >39 °C, ben al di sopra della temperatura media corporea umana di 37 °C ma non abbastanza alta da causare danni ai tessuti o ablazione; questo inizia a verificarsi a 43 °C, ma si verifica più rapidamente quando le temperature si avvicinano a 60 °C¹⁵. Sono stati utilizzati vari metodi per generare HT in vivo, tra cui laser, microonde, ablazione a radiofrequenza e ultrasuoni focalizzati, molti dei quali sono metodi di riscaldamento invasivi¹⁶. MRgHIFU è un metodo di riscaldamento non invasivo e non ionizzante che facilita le impostazioni precise della temperatura all’interno del tessuto target in situ. La risonanza magnetica (RM) fornisce fondamentalmente l’imaging in tempo reale, in cui è possibile utilizzare il software del computer, per calcolare una misurazione termometrica del tessuto durante il trattamento; Successivamente, questi dati possono essere utilizzati per controllare la terapia ad ultrasuoni in tempo reale per raggiungere e mantenere un set point di temperatura desiderato¹⁷. MRgHIFU è stato testato in vari tipi di tessuto e può essere utilizzato per una vasta gamma di trattamenti termici, dalla lieve HT all’ablazione, nonché clinicamente per trattare con successo le metastasi ossee dolorose¹⁸. Inoltre, HT ha dimostrato di causare citotossicità tumorale, modulare l’espressione proteica e alterare la risposta immunitaria nel microambiente tumorale 19,20,21,22. Uno studio ha combinato HT lieve con TLD, seguita da ablazione con MRgHIFU, in un modello sinergico di ratto R1²³, con conseguente necrosi nel nucleo tumorale e somministrazione di farmaci alla periferia. Tradizionalmente, la radioterapia è stata utilizzata come terapia aggiuntiva per danneggiare le cellule tumorali e ridurre la recidiva locale della malattia. Tuttavia, il suo uso è limitato dal dosaggio a vita e dal danno fuori bersaglio¹. Pertanto, HT è unico in quanto può causare alcuni degli stessi effetti senza le stesse tossicità o limitazioni.

I modelli animali preclinici per la RMS includono modelli immunocompetenti singeneici e xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) in ospiti immunocompromessi. Mentre i modelli immunocompromessi consentono la crescita dei tumori umani, mancano del microambiente tumorale appropriato e sono limitati nella loro capacità di studiare la risposta immunitaria²⁴. La mutazione attivante FGFR4 è un marcatore promettente per la prognosi sfavorevole e un potenziale bersaglio terapeutico nella^{RMS 1,25} adulta e pediatrica. Nei modelli singeneici di RMS sviluppati nel laboratorio Gladdy, i tumori sono in grado di crescere in un ospite immunocompetente, che sviluppa risposte immunitarie innate e adattative al tumore²⁶. Poiché la HT influenza la risposta immunitaria, l’osservazione del cambiamento nella risposta immunitaria murina è un prezioso vantaggio di questo modello tumorale. Per testare sia la risposta tumorale al TLD rispetto alla FD, sia il cambiamento nella risposta immunitaria del tumore sia alla chemioterapia che alla HT, è stato sviluppato un protocollo per trattare i tumori RMS murini singeneici in vivo utilizzando MRgHIFU e TLD, che è al centro di questo studio.

Protocol

La ricerca è stata eseguita in conformità con i comitati di cura degli animali con protocolli di uso degli animali approvati da un veterinario supervisore presso le strutture di ricerca animale del Centro per la fenogenomica (TCP) e del Centro risorse animali (ARC) della rete sanitaria universitaria (UHN). Tutte le procedure, escluso il MRgHIFU, che coinvolgono gli animali sono state eseguite in un armadio di sicurezza biologica (BSC) per ridurre al minimo l’esposizione degli animali all’aria esterna o alle infezioni s…

Representative Results

Utilizzando il protocollo di ipertermia generato da MRgHIFU, i tumori nell’arto posteriore sono stati in grado di essere costantemente riscaldati alla temperatura impostata desiderata per tutta la durata del trattamento (la Figura 4 mostra un trattamento rappresentativo, 10 o 20 min, n = 65). Per considerare un trattamento di successo, il ROI doveva essere mantenuto al di sopra di 39 °C per l’intero trattamento, con una variazione di <6 °C durante il trattamento e senza riscaldamento del t…

Discussion

Il protocollo qui sviluppato è stato utilizzato per colpire i tumori degli arti posteriori utilizzando MRgHIFU per il trattamento HT lieve e rilasciare farmaci incapsulati dai liposomi in vivo. Durante lo studio pilota sono stati riscontrati diversi passaggi critici in questo protocollo e l’ottimizzazione di questi passaggi critici ha rappresentato il miglioramento del successo del trattamento rispetto allo studio pilota. Il primo è la rimozione completa dei peli sulla zona da sonicare. Qualsiasi intrappolamen…

Materials

1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22363204
1kb plus DNA Ladder	Froggabio	DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)	Wisent	801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec	Bruker	T184931	70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler	Biorad	1851148
Clippers	Whal Peanut	8655
Compressed ultrasound gel	Aquaflex	HF54-004
Convection heating device	3M Bair Hugger	70200791401
Depiliatory cream	Nair	61700222611	Shopper's Drug Mart
DMEM	Wisent	219-065-LK
DNeasy extraction kit	Qiagen	69504
DPBS	Wisent	311-420-CL
Drug injection system	Harvard Apparatus	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant	Optixcare	50-218-8442
F10 Media	Wisent	318-050-CL
FBS	Wisent	081-105
Froggarose	FroggaBio	A87
Gel Molecular Imager	BioRad	GelDocXR
Glutamax	Wisent	609-065-EL
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100	Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)	SAI infusion	PE-20-100
Isoflurane	Sigma	792632
M25FV24C Cell line	Gladdy Lab	N/A
Microliter Syringe	Hamilton	01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR	Biorad	170-8170
Mouse holder	The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine	N/A	Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm.
MyRun Machine	Cosmo Bio Co Ltd	CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000-GL
p53 primers	Eurofins	N/A	Custom Primers
PCR tubes	Diamed	SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin	Wisent	450-200-EL
Proteus software	Pichardo lab	N/A
Respiratory monitoring system	SAII	Model 1030	MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS	Image Guided Therapy	N/A	LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter  25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 – 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency  2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe	ThermoFisher Scientific	S33102
TAE	Wisent	811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
Thermal probes	Rugged Monitoring	L201-08
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin	Wisent	325-052-EL
Ultrasound Gel	Aquasonic	PLI 01-08