Ixodes 견갑골에 대한 진드기 인공 막 공급
Summary
여기에 제시된 것은 다양한 진드기 수명 단계의 부분적 또는 전체 충혈을 허용하기 위해 인공 막 시스템을 통해 시험관 내에서 진드기를 혈액으로 공급하는 방법입니다.
Abstract
진드기 및 관련 질병은 공중 보건 및 수의학 부담으로 인해 중요한 연구 주제입니다. 그러나 연구 및 사육 중 진드기의 먹이 요구 사항은 실험 질문이나 실험실에서 진드기 및 관련 병원체를 연구하는 능력을 제한 할 수 있습니다. 인공 막 사료 공급 시스템은 이러한 문제를 줄이고 전통적인 동물 사료 공급 시스템으로는 불가능했을 수있는 새로운 연구 길을 열 수 있습니다. 이 연구는 모든 Ixodes 견갑골 수명 단계에서 공급 및 충혈 성공을 위해 정제 된 인공 막 공급 시스템을 설명합니다. 더욱이, 본 연구에서 기술된 인공 막 공급 시스템은 원하는 막 두께의 간단한 정제를 통해 다른 진드기 종과 함께 사용하도록 변형될 수 있다. 인공 막 공급 시스템의 이점은 시스템의 노동 집약도, 수유 성공에 영향을 미칠 수있는 추가 환경 요인, 진드기의 새로운 종 및 생활 단계에 대한 기술을 개선해야 할 필요성에 의해 상쇄됩니다.
Introduction
진드기 매개 질병은 전 세계 인간과 동물의 건강에 큰 영향을 미치며 2004년부터 2016년까지 미국에서 발생한 모든 매개체 관련 질병의 2/3 이상을 차지합니다1. 또한 최근 몇 년 동안 사례 수가 증가하고 있으며 더 많은 사람과 가축이 진드기 및 관련 질병의 영향을 받고 있습니다 2,3. 사례 수의 증가 추세에는 여러 가지 원인이있을 수 있지만 기후 변화는 중요한 요소입니다 3,4. 진드기 매개 질병 사례의 지속적인 증가는 진드기와 진드기가 전염시키는 병원체 간의 관계를 조사하기 위한 새로운 도구를 개발해야 할 필요성을 강조합니다.
진드기는 먹이를 먹는 동안 생리학 및 유전자 발현의 변화를 겪고 이러한 변화가 병원체 전파에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있습니다 5,6. 특히 설치류 모델이 특정 병원체에 감염되기 쉽지 않은 상황에서 동물 모델을 사용하여 병원체 전파 및 획득에 대한 전체 및 부분 섭식의 영향을 조사하는 연구를 수행하는 것은 어려울 수 있습니다. 예를 들어, Anaplasma phagocytophilum Variant-1 균주는 Ixodes scapularis와 사슴 사이에서 자연적으로 전염되지만 마우스를 감염시킬 수 없으므로 실험실7에서 진드기 감염을 복잡하게 만듭니다. 인공 사료 공급 시스템은 또한 전염 또는 감염을 억제하는 유전자 결실을 갖는 형질 전환 돌연변이의 사용을 통해 Borrelia burgdorferi와 같은 병원체를 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다8. 인공 수유 시스템을 사용하면 감염이나 전염이 진드기 측에서만 발생하도록함으로써 연구자가 유전자의 역할을 분리하여 그러한 연구를 혼란스럽게 할 수있는 숙주 반응을 분리하는 데 도움이됩니다.
유사하게, 질병 및 동물 전염과 관련된 진드기의 일부 생활 단계는 일반적인 실험실 모델 종을 먹도록 유도되지 않을 수 있습니다. 예를 들어, Ixodes 견갑골 암컷은 더 큰 동물, 일반적으로 토끼9를 먹여야합니다. 실험실 실험을 위해 종종 접근 할 수 있지만, 토끼를 사용하기위한 관리 및 축산 요구 사항은 작은 설치류의 요구 사항을 초과하며 일부 실험실에서는 금지 될 수 있습니다. 다른 진드기 종, 특히 수의학 우려 종은 대부분의 실험실에서 사용하기에 실용적이지 않은 소나 기타 큰 동물에게 먹여야 합니다. 인공 막 공급과 같은 체외 수유 및 감염 방법은 크거나 이국적인 숙주 동물을 사용하는 대안을 제공합니다.
또한 인공 사료 공급 시스템을 사용하면 전통적인 동물 사료 공급 방법으로는 불가능할 수있는 특정 분석이 가능합니다. 그러한 예 중 하나는 혈액 공급원을 공급 메커니즘으로부터 분리함으로써, 상이한 숙주의 혈액이 B. burgdorferi 전달에서 가질 수있는 역할의 검사가 가능해진다10. 숙주 혈액과 숙주 면역 반응이없는 경우 혈액 자체가하는 역할에 대한 이러한 검사는 병원체 전파주기를 이해하는 데 중요한 요소이며 인공 공급 시스템이 답을 도울 수있는 요소입니다11. 또한 숙주에서 전염 성공 및 확립을 조사하는 대신 사료 공급 중 병원체의 정확한 전달 수를 정량화하는 것이 가능해집니다 8,12.
딱딱한 진드기를 위해 만들어진 최초의 인공 먹이 막 중 일부는 1950 년대와 1960 년대에 동물 가죽이나 동물 유래 막으로 만들어졌습니다13,14. 이러한 멤브레인의 생물학적 특성으로 인해 새로운 멤브레인의 생산과 유통 기한에 문제가있었습니다. 1990 년대에는 실리콘 함침15,16으로 그물, 종이 또는 직물의 뒷면을 사용하는 완전 인공 멤브레인이 개발되었습니다. 실리콘은 물리적 특성이 피부의 신축성과 약간의 점착성과 생체 고유의 특성을 모방하기 때문에 이상적이었습니다. 이를 바탕으로 이 기술의 기반이 된 Krober와 Guerin은 I. ricinus17의 인공 공급을 위한 실리콘 함침 레이온 막 공급 기술을 설명했습니다.
밀접하게 관련된 종인 I. scapularis에 대한 방법의 개선은 막 함침에 사용되는 실리콘의 경도, 막 생산을위한 제조법, 챔버의 치수 및 부착 자극제에 현저한 차이를 가져 왔습니다. 이 연구에서보고 된 개선은 I. 견갑골에 사용하기 위해 Krober 및 Guerin을 기반으로 한 실리콘 기반 멤브레인을 개발 한 Andrade et al.이보고 한 것과 유사한 막 특성을 가져 왔지만, 실리콘 함침 단계에는 차이가 있으며, 이는 I. scapularis15의 미성숙 수명 단계에이 프로토콜을 활용할 수있는 유연성을 허용합니다. 18. 이 연구에서는 또한 이 방법의 반복 사용을 기반으로 한 추가 및 기술 변경, 성공적인 피드를 초래하는 모범 사례 및 발생할 수 있는 문제 해결에 대해 설명합니다. 이 방법은 모든 활성 생활 단계를 먹이고, 진드기를 병원성 박테리아로 감염시키고, 진드기를 여러 용량의 항생제19,20에 노출시키는 데 사용되었습니다. 표시된 인공 막 공급 방법은 I. 견갑골,이 방법은 막 두께를 약간 수정하면 다른 진드기 종에 쉽게 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
진드기의 인공 막 공급은 다양한 실험 절차에 유용한 도구를 제공하지만 모든 응용 분야에서 동물 사료를 대체 할 가능성은 없습니다. 동물 먹이없이 모든 생애 단계에서 진드기의 큰 식민지를 유지하는 것은 일반적으로지지 할 수 없습니다. 대신, 인공 사료 공급 시스템은 모델 숙주에 의해 지원되지 않는 병원체로 진드기를 감염시키거나, 단순화 된 사료 공급 환경에서 진드기에 대한 화합물 또…
Materials
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
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