מוצגת כאן שיטה להאכלת קרציות במבחנה באמצעות מערכת ממברנות מלאכותית המאפשרת גודש חלקי או מלא של מגוון שלבי חיים של הקרציות.
קרציות והמחלות הנלוות אליהן הן נושא מחקר חשוב בשל בריאות הציבור והנטל הווטרינרי שלהן. עם זאת, דרישות ההזנה של קרציות במהלך המחקר והגידול יכולות להגביל שאלות ניסוי או את יכולתן של מעבדות לחקור קרציות ואת הפתוגנים הקשורים אליהן. מערכת הזנה מלאכותית של ממברנות יכולה להפחית בעיות אלה ולפתוח כיווני מחקר חדשים שאולי לא היו אפשריים במערכות מסורתיות להאכלת בעלי חיים. מחקר זה מתאר מערכת הזנה מלאכותית של ממברנות ששוכללה להצלחת הזנה וגודש בכל שלבי החיים של Ixodes scapularis . יתר על כן, ניתן לשנות את מערכת הזנת הממברנות המלאכותית המתוארת במחקר זה לשימוש עם מיני קרציות אחרים באמצעות עידון פשוט של עובי הממברנה הרצוי. היתרונות של מערכת הזנה מלאכותית ממברנות מאוזנים על ידי אינטנסיביות העבודה של המערכת, הגורמים הסביבתיים הנוספים שעשויים להשפיע על הצלחת ההאכלה, והצורך לשכלל את הטכניקה עבור כל מין חדש ושלב החיים של הקרציות.
מחלות המועברות על ידי קרציות משפיעות מאוד על בריאותם של בני אדם ובעלי חיים ברחבי העולם, ואחראיות ליותר משני שלישים מכל המחלות הקשורות לווקטורים בארה”ב בין השנים 2004 ל -20161. בנוסף, מספר המקרים גדל בשנים האחרונות, כאשר יותר אנשים ובעלי חיים מושפעים מקרציות והמחלות הקשורות אליהן 2,3. בעוד שסביר להניח שיש סיבות רבות למגמת העלייה במספר המקרים, האקלים המשתנה הוא גורם חשוב 3,4. העלייה המתמשכת הצפויה במספר מקרי המחלה המועברת על ידי קרציות מדגישה את הצורך לפתח כלים חדשים לחקר היחסים בין קרציות לפתוגנים שהן מעבירות.
ידוע כי קרציות עוברות שינויים פיזיולוגיים וביטוי גנים במהלך ההאכלה וכי שינויים אלה ממלאים תפקיד בהעברת פתוגן 5,6. ייתכן שיהיה קשה לבצע מחקרים הבוחנים את ההשפעות של הזנה מלאה וחלקית על העברה ורכישה של פתוגנים באמצעות מודלים של בעלי חיים, במיוחד במצבים שבהם מודלים של מכרסמים אינם רגישים לזיהום על ידי פתוגן מסוים. לדוגמה, זן Anaplasma phagocytophilum Variant-1 מועבר באופן טבעי בין Ixodes scapularis לאיילים אך אינו מסוגל להדביק עכברים, מה שמסבך את זיהום הקרציות במעבדה7. מערכות הזנה מלאכותיות יכולות להיות מיושמות גם כדי לסייע בחקר פתוגנים כגון Borrelia burgdorferi באמצעות שימוש במוטציות טרנסגניות שיש להן מחיקות גנים המעכבות העברה או זיהום8. שימוש במערכת הזנה מלאכותית מסייע לחוקרים לבודד את תפקיד הגנים בכך שהוא מאפשר להדבקה או העברה להתרחש רק בצד הקרציה, ובכך לבודד כל תגובה פונדקאית שעלולה לבלבל מחקרים כאלה.
באופן דומה, ייתכן שחלק משלבי החיים של קרציות המעורבות במחלות ובהעברת בעלי חיים לא יופעלו כדי להיזון ממיני מודל מעבדה נפוצים. נקבות Ixodes scapularis , למשל, חייבות להיות מוזנות מבעלי חיים גדולים יותר, בדרך כלל ארנבות9. בעוד שלעתים קרובות נגיש לניסויי מעבדה, הדרישות המנהליות והחקלאיות של שימוש בארנבים עולות על אלה של מכרסמים קטנים ועשויות להיות אסורות עבור מעבדות מסוימות. מיני קרציות אחרים, במיוחד אלה המעוררים דאגה וטרינרית, חייבים להיות מוזנים בבקר או בבעלי חיים גדולים אחרים שאינם מעשיים לשימוש ברוב המעבדות. שיטות האכלה חוץ גופית וזיהום, כגון הזנת ממברנות מלאכותיות, מספקות חלופות לשימוש בבעלי חיים מארחים גדולים או אקזוטיים.
בנוסף, השימוש במערכת הזנה מלאכותית מאפשר ניתוחים מסוימים שאולי לא יהיו אפשריים בשיטות האכלה מסורתיות של בעלי חיים. דוגמה אחת לכך היא שעל ידי הפרדת מקור הדם ממנגנון ההזנה, מתאפשרת בחינת התפקיד שעשוי להיות לדם של פונדקאים שונים בהעברת B. burgdorferi 10. בדיקה זו של הדם המארח והתפקיד שהדם עצמו ממלא בהיעדר התגובה החיסונית של המאכסן היא גורם חשוב ביכולת להבין מחזורי העברה של פתוגנים וכזה שמערכות הזנה מלאכותיות מסוגלות לעזור לענות עליו11. כמו כן, ניתן לכמת את מספרי ההעברה המדויקים של פתוגן במהלך הזנה ולא רק לבחון את הצלחת השידור והתבססותו במארח 8,12.
חלק מממברנות ההזנה המלאכותיות הראשונות שיוצרו עבור קרציות קשות יוצרו מעורות בעלי חיים או מממברנות שמקורן בבעלי חיים בשנות ה-50 וה-60 של המאה ה-2013,14. בשל האופי הביולוגי של ממברנות אלה, היו בעיות הן בייצור של ממברנות חדשות והן בחיי מדף. בשנות ה-90 פותחו קרומים מלאכותיים לחלוטין שהשתמשו בגב של רשת, נייר או בד עם ספיגת סיליקון15,16. סיליקון היה אידיאלי מכיוון שתכונותיו הפיזיות מחקות את נחיצות העור ודביקות קלה, יחד עם טבעו הביולוגי. בהתבסס על כך, קרובר וגרין, שעל עבודתם התבססה טכניקה זו, תיארו טכניקת הזנה של קרום קרניים ספוג סיליקון עבור הזנה מלאכותית של I. ricinus17.
שכלול השיטות של I. scapularis, מין קרוב, הוביל להבדלים בולטים בקשיות הסיליקון המשמש בספיגת קרום, המתכון לייצור ממברנה, מידות התא וממריץ ההתקשרות. בעוד שהשכלולים שדווחו במחקר זה הביאו למאפייני קרום דומים לאלה שדווחו על ידי Andrade et al., שפיתחו גם קרום מבוסס סיליקון המבוסס על Krober ו- Guerin לשימוש ב- I. scapularis, קיים הבדל בשלבי ספיגת הסיליקון, המאפשר את הגמישות להשתמש בפרוטוקול זה לשלבי חיים לא בוגרים של I. scapularis15, 18. מחקר זה מתאר גם תוספות ושינויים טכניים המבוססים על שימוש חוזר ונשנה בשיטה זו, שיטות עבודה מומלצות שמביאות להזנה מוצלחת ופתרון בעיות שעלולות להתעורר. שיטה זו שימשה להאכלת כל שלבי החיים הפעילים, להדבקת קרציות בחיידקים פתוגניים ולחשיפת קרציות למינונים מרובים של אנטיביוטיקה 19,20. בעוד ששיטת האכלת הממברנה המלאכותית המוצגת היא עבור I. scapularis, שיטה זו ניתנת להתאמה בקלות למינים אחרים של קרציות עם שינויים קלים בעובי הממברנה.
האכלה מלאכותית של קרציות באמצעות ממברנות מספקת כלי שימושי למגוון הליכים ניסיוניים, אך לא צפויה להחליף את האכלת בעלי החיים בכל היישומים. שמירה על מושבות גדולות של קרציות בכל שלבי החיים ללא האכלת בעלי חיים היא בדרך כלל בלתי נסבלת. במקום זאת, מערכת ההזנה המלאכותית היא בעלת ערך למטרות אחרות כג…
00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
Super glue | cyanoacrylate glue | ||
Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |