Summary
Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.
Abstract
Ondanks opmerkelijke vooruitgang in het begrijpen van tumorbiologie, faalt de overgrote meerderheid van de kandidaat-oncologische geneesmiddelen die deelnemen aan klinische onderzoeken, vaak als gevolg van een gebrek aan klinische werkzaamheid. Dit hoge faalpercentage verlicht het onvermogen van de huidige preklinische modellen om de klinische werkzaamheid te voorspellen, voornamelijk vanwege hun ontoereikendheid in het weerspiegelen van tumorheterogeniteit en de micro-omgeving van de tumor. Deze beperkingen kunnen worden aangepakt met 3-dimensionale (3D) cultuurmodellen (sferoïden) die zijn vastgesteld op basis van menselijke tumormonsters die zijn afgeleid van individuele patiënten. Deze 3D-culturen vertegenwoordigen de biologie van de echte wereld beter dan gevestigde cellijnen die de heterogeniteit van de tumor niet weerspiegelen. Bovendien zijn 3D-culturen beter dan 2-dimensionale (2D) cultuurmodellen (monolaagstructuren) omdat ze elementen van de tumoromgeving repliceren, zoals hypoxie, necrose en celadhesie, en de natuurlijke celvorm en -groei behouden. In de huidige studie werd een methode ontwikkeld voor het bereiden van primaire culturen van kankercellen van individuele patiënten die 3D zijn en groeien in meercellige sferoïden. De cellen kunnen rechtstreeks worden afgeleid van patiënttumoren of van de patiënt afgeleide xenografts. De methode is breed toepasbaar op solide tumoren (bijv. Dikke darm, borst en long) en is ook kosteneffectief, omdat het in zijn geheel kan worden uitgevoerd in een typisch kankeronderzoek / celbiologisch laboratorium zonder afhankelijk te zijn van gespecialiseerde apparatuur. Hierin wordt een protocol gepresenteerd voor het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen (meercellige sferoïden) uit primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van twee complementaire benaderingen: een cel-levensvatbaarheidstest (MTT) en microscopisch onderzoek. Deze meercellige sferoïden kunnen worden gebruikt om potentiële kandidaat-geneesmiddelen te beoordelen, potentiële biomarkers of therapeutische doelen te identificeren en de mechanismen van respons en resistentie te onderzoeken.
Introduction
In vitro en in vivo studies vertegenwoordigen complementaire benaderingen voor het ontwikkelen van kankerbehandelingen. In vitro modellen maken de controle van de meeste experimentele variabelen mogelijk en vergemakkelijken kwantitatieve analyses. Ze dienen vaak als goedkope screeningplatforms en kunnen ook worden gebruikt voor mechanistische studies1. Hun biologische relevantie is echter inherent beperkt, omdat dergelijke modellen slechts gedeeltelijk de micro-omgeving van de tumor weerspiegelen1. In vivo modellen, zoals patiënt-afgeleide xenografts (PDX), vangen daarentegen de complexiteit van de tumormicro-omgeving en zijn meer geschikt voor translationele studies en individualisering van de behandeling bij patiënten (d.w.z. het onderzoeken van de respons op geneesmiddelen in een model afgeleid van een individuele patiënt)1. In vivo modellen zijn echter niet bevorderlijk voor high-throughput benaderingen voor geneesmiddelenscreening, omdat de experimentele parameters niet zo strak kunnen worden gecontroleerd als in in vitro modellen en omdat hun ontwikkeling tijdrovend, arbeidsintensief en kostbaar is 1,2.
In vitro modellen zijn al meer dan 100 jaar beschikbaar en cellijnen zijn al meer dan 70 jaar beschikbaar3. In de afgelopen decennia is de complexiteit van de beschikbare in vitro modellen van solide tumoren echter dramatisch toegenomen. Deze complexiteit varieert van 2-dimensionale (2D) cultuurmodellen (monolaagstructuren) die ofwel tumor-afgeleide gevestigde cellijnen of primaire cellijnen zijn tot de meer recente benaderingen met 3-dimensionale (3D) modellen1. Binnen de 2D-modellen is een belangrijk onderscheid tussen de gevestigde en primaire cellijnen4. Gevestigde cellijnen worden vereeuwigd; Daarom kan dezelfde cellijn wereldwijd gedurende vele jaren worden gebruikt, wat vanuit een historisch perspectief samenwerking, de accumulatie van gegevens en de ontwikkeling van vele behandelingsstrategieën vergemakkelijkt. Genetische afwijkingen in deze cellijnen hopen zich echter op met elke passage, waardoor hun biologische relevantie in gevaar komt. Bovendien weerspiegelt het beperkte aantal beschikbare cellijnen niet de heterogeniteit van tumoren bij patiënten 4,5. Primaire kankercellijnen zijn rechtstreeks afgeleid van gereseceerde tumormonsters verkregen via biopsieën, pleurale effusies of resecties. Daarom zijn primaire kankercellijnen biologisch relevanter omdat ze elementen van de micro-omgeving van de tumor en tumorkenmerken behouden, zoals intercellulair gedrag (bijv. Cross-talk tussen gezonde en kankercellen) en de stamachtige fenotypen van kankercellen. De replicerende capaciteit van primaire cellijnen is echter beperkt, wat leidt tot een smalle kweektijd en het aantal tumorcellen beperkt dat kan worden gebruikt voor analyses 4,5.
Modellen met 3D-culturen zijn biologisch relevanter dan 2D-cultuurmodellen, omdat de in vivo omstandigheden behouden blijven. Zo behouden 3D-cultuurmodellen de natuurlijke celvorm en -groei en repliceren ze elementen van de tumoromgeving, zoals hypoxie, necrose en celadhesie. De meest gebruikte 3D-modellen in kankeronderzoek omvatten meercellige sferoïden, op steigers gebaseerde structuren en matrix-ingebedde culturen 4,6,7.
Het huidige protocol genereert 3D-tumorcultuurmodellen (meercellige sferoïden) uit primaire kankercellen en evalueert hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van twee complementaire benaderingen: een cel-levensvatbaarheidstest (MTT) en microscopisch onderzoek. De representatieve resultaten die hierin worden gepresenteerd, zijn van borst- en darmkanker; Dit protocol is echter breed toepasbaar op andere solide tumortypen (bijv. Cholangiocarcinoom, maag-, long- en alvleesklierkanker) en is ook kosteneffectief, omdat het in zijn geheel kan worden uitgevoerd in een typisch kankeronderzoek / celbiologisch laboratorium zonder te vertrouwen op gespecialiseerde apparatuur. De meercellige sferoïden die met behulp van deze aanpak worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om potentiële kandidaat-geneesmiddelen te beoordelen, potentiële biomarkers of therapeutische doelen te identificeren en de mechanismen van respons en resistentie te onderzoeken.
Dit protocol is verdeeld in drie secties: (1) het genereren, verzamelen en tellen van de sferoïden ter voorbereiding op hun gebruik als model voor het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen; (2) MTT-test om de werkzaamheid van het geneesmiddel op de sferoïden te beoordelen; en (3) de microscopische evaluatie van morfologische veranderingen na de behandeling van de sferoïden met geneesmiddelen als een andere benadering voor het evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen (figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De verzameling van menselijke tumormonsters die werden gebruikt voor de primaire tumorcelculturen werd uitgevoerd volgens de door de institutionele beoordelingsraad (IRB) goedgekeurde protocollen in het Rabin Medical Center met schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënten. Patiënten die in aanmerking kwamen voor deelname aan de studie waren mannelijke en vrouwelijke volwassen en pediatrische kankerpatiënten met niet-gemetastaseerde borst-, darm-, lever-, long-, neuro-endocriene, eierstok- of pancreaskanker, kinderkanker of gemetastaseerde kanker. Het enige uitsluitingscriterium was het gebrek aan capaciteit om geïnformeerde toestemming te geven.
1. Generatie en verzameling van sferoïden
OPMERKING: De isolatie van primaire tumorcellen kan worden uitgevoerd zoals beschreven door Kodak et al.8. Belangrijk is dat primaire tumorcellen die worden gebruikt voor het genereren van de sferoïden direct kunnen worden afgeleid van patiëntmonsters verkregen door biopsie, resectie, enz., Of indirect met behulp van tumormonsters van patiënt-afgeleide xenograft (PDX) -modellen, zoals beschreven door Moskovits et al.9.
- Bereid een eencellige suspensie van aanhangende primaire tumorcelculturen van 75% -100% samenvloeiing door een kleine kolf (T25) te nemen met een eencellige aanhangende primaire celcultuur, de celkweekmedia te verwijderen, te wassen met PBS en vervolgens 1 ml 1x Accutase (een celloslatingsoplossing) toe te voegen (zie de tabel met materialen) gedurende 3 minuten bij 37 °C.
- Neutraliseer de Accutase-oplossing door 5 ml celkweekmedium toe te voegen (RPMI-1640 kweekmedium aangevuld met 10% FBS, 1:100 penicilline-streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren en 1% L-glutamine; zie de tabel met materialen).
- Zuig de cellen op met een serologische pipet van 10 ml en deponeer ze in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de buis op 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het celkweekmedium, voeg 5 ml vers celkweekmedium toe aan de celkorrel en meng voorzichtig.
- Tel de levensvatbare cellen met een hemocytometer10. Neem hiervoor een aliquot van 50 μL van de celsuspensie en meng deze met 50 μL trypan blauw. Tel de levende cellen (de cellen die negatief zijn voor de blauwe kleur) en bereken het totale aantal levende cellen in de suspensie.
- Bereid een "3D-kweekmedium" voor (een celkweekmedium aangevuld met 5% keldermembraanmatrix; zie de materiaaltabel).
OPMERKING: Het "3D-cultuurmedium" is vloeistofachtig bij kamertemperatuur. Bij 37 °C wordt de consistentie meer gelachtig (zodat de cellen bij elkaar blijven), hoewel het nog steeds kan worden gepipetteerd (omdat het slechts 5% keldermembraanmatrix bevat). - Bereken het aantal cellen dat nodig is voor de bepaling en het totale benodigde volume; elke put moet 2.000-8.000 cellen bevatten in 200 μL medium.
- Bereid een celsuspensie met het gewenste aantal cellen (bijv. 4.000 cellen) in 200 μL van het "3D-kweekmedium" en meng voorzichtig met de pipet om een homogene verdeling te garanderen.
- Breng de suspensie over in een pipetteerreservoir. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 200 μL van de celsuspensie toe aan elke put van een ultralage 96-putplaat (zie de materiaaltabel). Meng vóór elke verzameling van de cellen de suspensie goed.
- Centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g om de clustering van de cellen af te dwingen, waardoor de celaggregatie wordt verbeterd, en incubeer de plaat bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
- Ververs elke 2-3 dagen het "3D-cultuurmedium". Centrifugeer de plaat op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, verwijder voorzichtig 50% van het medium (100 μL) en gooi het weg en voeg 100 μL vers "3D-kweekmedium" toe om de bestaande oplossing te vervangen. Herhaal stap 1.11 en plaats de plaat terug in de 37 °C, 5% CO2 bevochtigde incubator.
OPMERKING: Het medium moet worden verwijderd wanneer de plaat op 45° wordt gehouden en het medium mag alleen uit het bovenste deel worden verzameld om te voorkomen dat de cellen worden verzameld. Een vacuümafzuigsysteem mag niet worden gebruikt. Het verse medium moet langzaam en voorzichtig worden toegevoegd om de sferoïden, die zich al beginnen te vormen, niet te verstoren. - Inspecteer de cellen elke 1-2 dagen onder een microscoop om de vorming van sferoïden te controleren. Meet de diameter van de gevormde sferoïden met behulp van het hulpmiddel "schaal" in de beeldvormingssoftware (zie de materiaaltabel).
OPMERKING: Microscopische inspectie moet eerst onregelmatige ronde tot ovale lichamen onthullen die een bolvormige vorm aannemen naarmate de tijd vordert11,12.- Wanneer de sferoïde diameter 100-200 μm bereikt, voert u de experimenten met de werkzaamheid van het geneesmiddel uit.
OPMERKING: De experimenten met de werkzaamheid van het geneesmiddel worden uitgevoerd wanneer de sferoïden deze diameter bereiken, omdat op dat moment de meerderheid van de cellen zich vermenigvuldigt, wat bevorderlijk is voor het evalueren van de respons op de behandeling. Sferoïden met een grotere diameter bevatten een necrotische kern en een rustlaag11,12, wat resulteert in een kleiner deel van de prolifererende cellen die reageren op de behandeling.
- Wanneer de sferoïde diameter 100-200 μm bereikt, voert u de experimenten met de werkzaamheid van het geneesmiddel uit.
- Gebruik voor het verzamelen van sferoïden een pipet van 1.000 μL om de sferoïden uit elke put te verzamelen en deponeer ze in een conische buis van 15 ml.
OPMERKING: Sferoïden zijn inherent kwetsbaar en vereisen een voorzichtige behandeling. Wanneer u het medium met de sferoïden in de conische buis overbrengt, houdt u de buis op 45° en pipet u langzaam op de wand van de buis. Sferoïden zijn zichtbaar voor het oog. - Centrifugeer de conische buis gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g en zuig het supernatant voorzichtig op en gooi het weg met behulp van een pipet.
- Voeg 0,5 ml van het celkweekmedium toe en resuspensie de pellet goed maar voorzichtig. Vermijd het maken van bubbels.
- Voer sferoïde tellen uit volgens de onderstaande stappen.
- Gebruik een plaat met 96 putten en teken een plusteken aan de onderkant van een put om de put in kwadranten te verdelen (om de telling bij te houden).
- Voeg 50 μL van de suspensie toe aan de put en tel de sferoïden handmatig onder de microscoop (met behulp van een 10x objectieflens).
- Tel de sferoïden in elk kwadrant, pas op dat u niet dubbel telt en bereken het totale aantal sferoïden in de put.
OPMERKING: Voor de nauwkeurigheid van de telling, tel ten minste 50 sferoïden in een put. Als er minder dan 50 sferoïden zijn, meng dan voorzichtig de suspensie om een homogene verdeling te garanderen en tel opnieuw met behulp van een groter volume van de suspensie toegevoegd aan een nieuwe put. Als alternatief, als er minder dan 50 sferoïden in een put zijn, kunnen de sferoïden worden gecentrifugeerd en voorzichtig worden geresuspendeerd in een volume van <0,5 ml. Als er meer dan 100 sferoïden zijn, voeg dan celkweekmedium toe aan de sferoïde suspensie, meng voorzichtig en vertel. - Bereken de sferoïdeconcentratie (sferoïde telling/telvolume [μL]) en bereken vervolgens het totale aantal sferoïden in de suspensie (sferoïdeconcentratie × totale volume).
2. Drug efficacy assay (MTT assay)
NOOT: Voor details, zie van Meerloo et al.13. Ook moet voor de MTT-test alleen het celkweekmedium worden gebruikt en niet het "3D-kweekmedium" (het toevoegen van de keldermembraanmatrix is niet nodig en kan mogelijk de MTT-test verstoren).
- Bereid in een nieuwe buis een sferoïde suspensie in een concentratie van 200 sferoïden per 200 μL celkweekmedium (RPMI-1640 kweekmedium aangevuld met 10% FBS, 1:100 penicilline-streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren en 1% L-glutamine).
- Bereid voor elke medicamenteuze behandeling een voorraad sferoïden voor in een buis van 15 ml. Bereken de hoeveelheid die nodig is voor elk medicijn door het aantal putten dat nodig is voor herhalingen: (5-8) × 200 μL. Voeg het medicijn toe aan de buis tot de uiteindelijke concentratie die nodig is.
OPMERKING: Zie de representatieve resultatensectie met betrekking tot de geneesmiddelen die voor deze studie worden gebruikt en hun dosering. Ook worden de commerciële details van de geneesmiddelen vermeld in de tabel met materialen.
- Bereid voor elke medicamenteuze behandeling een voorraad sferoïden voor in een buis van 15 ml. Bereken de hoeveelheid die nodig is voor elk medicijn door het aantal putten dat nodig is voor herhalingen: (5-8) × 200 μL. Voeg het medicijn toe aan de buis tot de uiteindelijke concentratie die nodig is.
- Breng 200 μL van de sferoïde suspensie over in de putjes van een ultralage 96-putplaat en incubeer de plaat bij 37 °C in een 5% CO 2-bevochtigde incubator. Gebruik niet de externe rijen en kolommen van de 96-putplaat voor de test, omdat deze putten worden gekenmerkt door verhoogde verdamping, wat kan leiden tot verhoogde variabiliteit tussen de herhalingsexperimenten; voeg in plaats daarvan PBS toe aan deze putten.
OPMERKING: Het is belangrijk dat de cultuur van de sferoïden homogeen is voordat de cultuur wordt gealiquoteerd in de 96-putplaat. Ook moet een controlevoorwaarde (d.w.z. onbehandelde sferoïden) in elk experiment worden opgenomen. - Na het incuberen van de sferoïden met het onderzoeksgeneesmiddel gedurende 24-72 uur, centrifugeert u de plaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g en verwijdert u voorzichtig 170 μL van het celkweekmedium, waardoor 30 μL (inclusief de sferoïden) op de bodem van de put achterblijft.
OPMERKING: Het verwijderen van de 170 μL celkweekmedium moet zorgvuldig worden gedaan, om de sferoïden niet te verwijderen. Houd de plaat op 45° en plaats één hand (met een donkere handschoen voor contrast) onder de putjes zodat de sferoïden zichtbaar zijn (witte stippen). - Bereid de MTT-oplossing (0,714 mg/ml in fenolvrije RPMI, zie de tabel met materialen).
- Voeg 70 μL MTT-oplossing toe aan elk putje tot een eindvolume van 100 μL per put (de uiteindelijke MTT-concentratie in de put is 0,05 mg per 100 μL). Bereid bovendien "Blanke" putten voor met MTT-oplossing zonder cellen.
OPMERKING: MTT is lichtgevoelig. Daarom moet het licht in de kap worden uitgeschakeld en moet de buis met de MTT-oplossing worden bedekt met aluminiumfolie. - Incubeer de plaat bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 3-4 uur totdat een verandering in de kleur van de oplossing in de putten (paarse kleur vertegenwoordigt levende cellen) wordt waargenomen.
- Wanneer een verandering wordt waargenomen, voegt u 100 μL stopoplossing (0,1N HCl in isopropanol) toe aan elke put en mengt u voorzichtig de inhoud van de putten zonder bubbels te creëren.
- Lees de absorptie van de plaat af in een Fluorometer-ELISA-lezer (zie de Materiaaltabel) bij een golflengte van 570 nm en een achtergrondgolflengte van 630-690 nM.
OPMERKING: Als de beschikbare fluorometer-ELISA-lezer de 96-putplaat met ultralage bevestiging niet kan lezen, breng dan de inhoud van elke put over naar een overeenkomstige 96-putplaat met vlakke bodem. - Bereken de levensvatbaarheid van de cel volgens de onderstaande stappen.
- Bereken voor elke put het "specifieke signaal" ("specifiek signaal" = het signaal bij 570 nm - het signaal bij 630-690 nm). Bereken vervolgens de gemiddelde waarde van de "Blanke" putten en trek deze waarde af van elke put.
- Bereken het gemiddelde van de "specifieke signalen" in de controleputten die cellen bevatten die niet met het onderzoeksgeneesmiddel zijn behandeld ("AV-SS-unt").
- Bereken de levensvatbaarheid (percentage) van cellen in elke put ten opzichte van de putten met onbehandelde cellen.
OPMERKING: Levensvatbaarheid = (specifiek signaal in elke put/"AV-SS-unt") × 100
3. Monitoren en analyseren van de morfologische veranderingen in de sferoïden
OPMERKING: Wat de MTT-test betreft, mag bij deze evaluatie alleen het celkweekmedium en niet het "3D-kweekmedium" worden gebruikt (het toevoegen van de keldermembraanmatrix is niet nodig en kan de analyse mogelijk verstoren).
- Na het tellen van de sferoïden, verdunt u de suspensie in celkweekmedium (RPMI-1640 kweekmedium aangevuld met 10% FBS, 1:100 penicilline-streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren en 1% L-glutamine) tot ongeveer 1-2 sferoïden per 20 μL.
- Plaats 80 μL celkweekmedium in de putjes van een ultralage 96-putplaat en voeg vervolgens 20 μL van de sferoïde suspensie toe aan de putjes.
OPMERKING: De putten bevatten daarom 1-2 sferoïden in een volume van 100 μL. - Controleer de putten zorgvuldig onder de microscoop en markeer de putten die één sferoïde bevatten, omdat ze voor deze analyse zullen worden gebruikt.
- Bereid het onderzoeksgeneesmiddel voor in een concentratie die tweemaal de concentratie van belang is. Voeg 100 μL van de geneesmiddeloplossing toe aan de relevante putten (de totale concentratie in de put is dan 1x).
- Leg een afbeelding van elke put vast op dag 0 (voordat u het onderzoeksgeneesmiddel toevoegt) en gebruik de "schaal" -tool in de beeldvormingssoftware (zie de tabel met materialen) om de diameters van de sferoïden te bepalen.
- Incubeer de plaat bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator en onderzoek de morfologie en meet de diameter van de sferoïden (met behulp van de "schaal" -tool) dagelijks gedurende 3-7 dagen, afhankelijk van wanneer het geneesmiddeleffect wordt waargenomen (bijv. Celverspreiding, invasieve peulen, structuurvernietiging, enz.).
- Plot aan het einde van het experiment de veranderingen in sferoïde diameters (ten opzichte van dag 0) in de loop van de tijd.
OPMERKING: Verandering (percentage) = (sferoïde diameter op een specifieke dag/de diameter van die sferoïde op dag 0) × 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol presenteert procedures voor het genereren van een homogene cultuur van sferoïden uit primaire tumorcellen, het kwantitatief evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen op sferoïdecultuur (MTT-test) en het bepalen van het effect van studiegeneesmiddelen op sferoïde morfologie. Gegevens van de representatieve experimenten in sferoïden gegenereerd uit colon- en borstkankercelculturen worden gepresenteerd. Vergelijkbare experimenten werden uitgevoerd met behulp van andere tumortypen, waaronder cholangiocarcinoom, maag-, long- en alvleesklierkanker (gegevens niet getoond). Alle hierin gepresenteerde experimenten werden in drievoud uitgevoerd.
Figuur 2 toont de sferoïden die werden gegenereerd uit de primaire darmkankercelcultuur. Zoals te zien is in figuur 2, hangt het aantal gegenereerde sferoïden af van het aantal cellen dat aanvankelijk in elke put is gezaaid. De groei van de sferoïden tot meer dan 100 μm in diameter duurde 10-14 dagen. De oorsprong van de tumorcellen (bijvoorbeeld verschillende patiënten en verschillende oorsprong) bepaalde de groeisnelheid. Het zaaien van de putten met meer cellen verkortte niet de tijd die nodig was voor het genereren van sferoïden, maar verhoogde eerder het aantal gevormde sferoïden. Met name bij langdurige kweek van de darmkankersferoïden begonnen ze zich aan elkaar te hechten en vormden ze clusters van sferoïden in druifachtige structuren (figuur 3), die een homogene cultuur voorkwamen en dus het gebruik van de sferoïden in de MTT-testen verboden.
Figuur 4 toont het effect van drie behandelingen (10 μM palbociclib, 10 μM sunitinib en hun combinatie bij elk 10 μM) op de levensvatbaarheid van sferoïden afgeleid van twee primaire kankers. In dit geval werd eerst een PDX-model opgesteld en werden de tumorcellen die voor de sferoïdeanalyse werden gebruikt, afgeleid van het PDX-model9. Het eerste PDX-model werd vastgesteld met behulp van een darmkankermonster van een 50-jarige mannelijke patiënt en het tweede met behulp van een borstkankermonster van een 62-jarige vrouw. Zoals aangetoond in figuur 4A,B, leidde de combinatie van palbociclib plus sunitinib na 3 dagen behandeling tot een significante vermindering van de levensvatbaarheid zoals gemeten door de MTT-test. Zoals aangetoond in figuur 4C,D, waren de morfologische veranderingen die optraden tijdens de behandeling zeer duidelijk. Op dag 0 waren alle sferoïden intact. Op dag 3 daarentegen waren de met de controle behandelde sferoïden (DMSO) nog intact, terwijl de met de combinatie behandelde sferoïden werden gedemonteerd en hun morfologie "open" was, waarbij cellen loskwamen van de vaste structuur, wat de vernietiging van de sferoïde structuur suggereert.
Figuur 5 toont de follow-up van de sferoïden in de tijd. Deze sferoïden, gegenereerd uit borstkankercellen afkomstig van een 44-jarige vrouwelijke patiënt, werden behandeld met een van de twee combinaties (trastuzumab [10 μg / ml] plus vinorelbine [1 μg / ml], of 5-fluorouracil [200 μM] plus cisplatine [300 μM]). Zoals weergegeven in figuur 5A, was de grootte van de sferoïden behandeld met 5-fluorouracil plus cisplatine verminderd op dag 3 en waren de sferoïden volledig vernietigd op dag 7. Daarentegen had de behandeling met trastuzumab plus vinorelbine slechts een klein effect op de morfologie van de sferoïden (bijv. een bepaald niveau van een "open" structuur), maar het effect was niet significant. Figuur 5B toont de gemiddelde verandering in de diameter van de sferoïden ten opzichte van dag 0 (in elke behandelingsgroep werden vijf sferoïden gevolgd).
Figuur 1: Overzicht van het protocol voor het vaststellen van 3D-sferoïden uit patiënt-afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vorming van sferoïden uit een primaire darmkankercelcultuur in de loop van de tijd door het aantal aanvankelijk gezaaide cellen. Verschillende aantallen cellen werden gezaaid in "3D-kweekmedium" in een ultralage aanhechtingsplaat met 96 putten en waargenomen onder de microscoop (4x vergroting). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Sferoïden van primaire darmkankercellen (met initiële celzaaiing van 2.000 per put) na 12 dagen in cultuur. De twee voorbeelden (A,B) tonen clusters die ontstaan door de aanhechting van sferoïden aan elkaar (10x vergroting). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De effecten van palbociclib (10 μM), sunitinib (10 μM) en hun combinatie (elk 10 μM) op sferoïden van primaire tumorcellen, waaronder darm- en borstkanker (PDX-afgeleid). Een MTT-test werd uitgevoerd op sferoïden afgeleid van (A) colon- en (B) borstkankercellen. De MTT-signalen werden genormaliseerd naar waarden van met DMSO behandelde cellen. De waarden vertegenwoordigen de gemiddelden van vier tot acht replicaties. De foutbalken vertegenwoordigen SEM. *p < 0,05 versus een enkele agent (t-test). De effecten van de verschillende behandelingen op de celgroei werden ook microscopisch geëvalueerd op dag 0 en na 3 dagen behandeling van de sferoïden afgeleid van (C) colon- en (D) borstkankercellen (10x vergroting). Schaalbalk = 100 μm. De figuur is overgenomen uit Moskovits et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De effecten van trastuzumab (10 μg/ml) plus vinorelbine (1 μg/ml) en 5-fluorouracil (200 μM) plus cisplatine (300 μM) op sferoïden afgeleid van borstkanker in de loop van de tijd. (A) Elke put bevatte één sferoïde en werd in de loop van de tijd onder de microscoop gevolgd (10x vergroting). Schaalbalk = 100 μm. (B) De verandering in de diameter van de sferoïden (ten opzichte van dag 0) door de duur van de behandeling. *p = 0,05 voor 5-fluorouracil plus cisplatine versus controles (t-test). Elke behandelingsgroep omvatte vier tot zes putten, met één sferoïde in elke put. De gemiddelde verandering wordt weergegeven. De foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het genereren van 3D primaire celculturen (sferoïden) afgeleid van menselijke tumormonsters. Deze sferoïden kunnen worden gebruikt voor verschillende analyses, waaronder het evalueren van potentiële kandidaat-geneesmiddelen en medicijncombinaties, het identificeren van potentiële biomarkers of therapeutische doelen en het onderzoeken van de mechanismen van respons en resistentie. Het protocol maakt gebruik van primaire tumorcellen die rechtstreeks zijn afgeleid van patiëntmonsters of tumorcellen uit PDX-modellen, die kunnen worden vastgesteld met behulp van patiëntmonsters. De laatste benadering maakt het mogelijk om in vitro en in vivo experimenten uit te voeren met dezelfde primaire tumor. Consistentie is eerder aangetoond in de resultaten van geneesmiddelengevoeligheidsexperimenten tussen PDX-modellen en 3D-culturen afgeleid van deze modellen9, waardoor de relevantie van deze in vitro / in vivo benadering wordt ondersteund.
De belangrijkste voordelen van het huidige protocol zijn de brede toepasbaarheid op de meeste solide tumoren en de kosteneffectiviteit, die voortvloeit uit de compatibiliteit met de typische mogelijkheden / apparatuur van kankeronderzoek / celbiologische laboratoria (d.w.z. geen behoefte aan gespecialiseerde apparatuur of outsourcing). Bovendien genereert het huidige protocol een homogene sferoïde populatie, die het gebruik van kwantitatieve levensvatbaarheidstests met hoge doorvoer (bijv. MTT) mogelijk maakt. Het genereren van een homogene sferoïde populatie is belangrijk voor het verkrijgen van zinvolle resultaten, omdat studies hebben aangetoond dat de sferoïde grootte de respons op de behandeling beïnvloedt. Grotere sferoïden worden, in tegenstelling tot kleinere sferoïden, gekenmerkt door een necrotische kern. De meeste cellen bevinden zich echter in de lineaire groeifase in kleinere sferoïden. Bovendien beïnvloedt de grootte van de sferoïde ook de stijfheid van de weefselstructuur, wat van invloed kan zijn op de diffusie van verbindingen (zoals die welke worden gebruikt voor de levensvatbaarheidstests) in de sferoïde14. De belangrijkste beperking van het huidige protocol is dat, zelfs met zijn brede toepasbaarheid, er gevallen zijn waarin de aanpak er niet in slaagt om sferoïden te genereren. Belangrijk is dat een dergelijk falen niet tumortypespecifiek is, maar eerder patiëntspecifiek. Aanvullende studies zijn nodig om te onderzoeken waarom tumormonsters van bepaalde patiënten geen sferoïden vormen met behulp van dit protocol.
Het huidige protocol is gebaseerd op twee belangrijke principes: (1) het hebben van een celsuspensie zonder celclusters (d.w.z. een eencellige suspensie) en (2) het gebruik van een ultralage bevestigingsplaat met een medium met 5% keldermembraanmatrix (een opgeloste extracellulaire matrix). Het initiële aantal gezaaide cellen beïnvloedt het aantal sferoïden dat wordt gevormd, maar niet de tijd die nodig is voor sferoïdevorming, wat suggereert dat elke sferoïde wordt gegenereerd uit een enkele tumorcel. Met name de clustering van sferoïden treedt op, vooral na langdurige incubatie. Deze clustering verstoort de homogene cultuur en verbiedt het gebruik van MTT (vanwege de moeilijkheid om een gelijk aantal sferoïden in elke put af te geven). Deze clustering kan worden vermeden door de cultuur te verdunnen en de sferoïden over te brengen naar grotere putten. Als een homogene cultuur niet kan worden bereikt, kunnen MTT-tests niet worden gebruikt, hoewel de morfologische beoordeling en de meting van de sferoïde diameters nog steeds kunnen worden uitgevoerd. Opgemerkt moet worden dat de morfologische beoordeling arbeidsintensiever is, omdat het de toewijzing van één sferoïde per put en de monitoring van elke sferoïde onder de microscoop vereist.
Het bepalen van het juiste aantal sferoïden voor een MTT-test is belangrijk voor de interpretatie ervan. Het wordt dus aanbevolen om eerst een standaardcurve te genereren met bekende aantallen sferoïden (bijv. 50, 100, 200 en 400 per put, in replicaties) om het optimale aantal sferoïden voor de MTT-test te bepalen. Het midden van het lineaire bereik van de grafiek moet worden gebruikt voor de analyse, zodat er voldoende sferoïden zijn om een signaal te detecteren, maar niet te veel (d.w.z. zodat de plateaufase van het signaal niet wordt bereikt). Bovendien maakt het gebruik van het middenbereik het mogelijk om het signaal binnen het lineaire bereik te houden in gevallen van respons op het medicijn (d.w.z. verminderd signaal), evenals non-respons (d.w.z. de voortdurende groei van het sferoïde en verhoogde signaal). Ten slotte, aangezien de MTT-test de celmetaboolactiviteit beoordeelt, die kan verschillen tussen tumoren van verschillende patiënten, moet een standaardcurve worden gegenereerd voor elk primair tumormonster.
Samenvattend vormt dit protocol voor het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen uit primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van een cel-levensvatbaarheidstest (MTT) en morfologisch onderzoek onder de microscoop een waardevol, biologisch relevant hulpmiddel dat de huidige 2D-in vitro-benaderingen en de in vivo benaderingen aanvult.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
